二十二碳六烯酸介導(dǎo)MAPK途徑抗房顫的作用及機(jī)制研究

徐慶梅，莫 辰，朱飛宇，張 恒，王洪巨，高 琴，康品方，唐 碧

心房顫動(dòng)(atrial fibrillation，AF)簡稱房顫，主要表現(xiàn)為心臟迅速而又不規(guī)則地跳動(dòng)，是臨床上最常見的一種心律失常，其發(fā)病率及致死率居高不下，危害性堪比惡性腫瘤，嚴(yán)重影響病人的生命質(zhì)量[1]。心房纖維化的特征在于心肌成纖維細(xì)胞異常增殖所致的心肌細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的異常積累[2]，它作為AF發(fā)生的觸發(fā)器，可引起心房電傳導(dǎo)異常，更易形成折返，有利于AF的發(fā)作和維持，是AF發(fā)生、發(fā)展的病理基礎(chǔ)[3]。二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)屬于ω-3多不飽和脂肪酸家族中的重要成員，在膳食魚類中廣泛存在。研究[4]表明，增加多不飽和脂肪酸的攝入可有效降低冠心病和心血管疾病事件發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。最新研究[5]也證實(shí)，多不飽和脂肪酸可發(fā)揮抗AF的作用。絲裂原激活蛋白激酶磷酸酶(mitogen activates protein kinase phosphatase,MKP-1)是一種蘇氨酸/酪氨酸磷酸酯酶，可調(diào)控絲裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPKs)及P38磷酸化狀態(tài)。正常情況下，MAPKs和MKP-1處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，這種平衡狀態(tài)在決定細(xì)胞生存或凋亡方面起重要作用[6]。另有研究[7]發(fā)現(xiàn),MAPK通路可介導(dǎo)成纖維細(xì)胞的增殖和遷移。而DHA是否通過影響P38 MAPK通路發(fā)揮抗AF的作用尚未見報(bào)道。本研究觀察DHA對大鼠心房纖維化的影響，并探討該作用是否與調(diào)控P38 MAPK通路介導(dǎo)的膠原表達(dá)有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑 SD雄性大鼠80只，體質(zhì)量(220±20)g，由蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。氯化乙酰膽堿購于Sigma公司，單克隆鼠抗P38、P-P38、MKP-1抗體及β-actin 抗體均購于Santa Cruz公司，單克隆二抗購自武漢博士德公司；大鼠Ⅰ型、Ⅲ型膠原ELISA試劑盒購于上海慧嘉生物公司，PBS購于Hyclone公司，其余試劑均為國產(chǎn)分析純級別。MedLab生物信號采集處理系統(tǒng)(U/4C501H)購于南京美易科技有限公司，低溫高速離心機(jī)(5810R)于德國Eppendor公司購買，膜片鉗相關(guān)儀器設(shè)備由美國Axon公司提供，免疫印跡配套設(shè)備購于美國BIO-RAD公司。

1.2 AF動(dòng)物模型制備與分組

1.2.1 大鼠初篩與分組 雄性SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，尾靜脈注射[8]66 μg/mL乙酰膽堿與50 mg/mL氯化鈣混合液，心電圖(標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián))全程記錄。剔除乙酰膽堿-氯化鈣混合液不敏感大鼠，最終選擇80只，隨機(jī)分為對照組(CON組)、對照DHA處理組(DHA組)、AF組和AF+DHA處理組(DHA+AF組)，每組20只。

1.2.2 AF模型復(fù)制 AF模型組連續(xù)3 d尾靜脈注射乙酰膽堿-氯化鈣混合液，每天給藥1次，Ⅱ?qū)碾妶D顯示P波消失、出現(xiàn)f波的典型AF心電圖視為模型復(fù)制成功[8]。

1.2.3 分組干預(yù)處理 第4天開始，CON組給予0.9%氯化鈉溶液，DHA組給予DHA溶液(10 mg/mL)和0.9%氯化鈉溶液，AF組給予0.9%氯化鈉溶液和乙酰膽堿-氯化鈣混合液，DHA+AF組給予DHA溶液和乙酰膽堿-氯化鈣混合液，給藥方式均為尾靜脈注射，給藥劑量均為0.1 mL/100 g，每天給藥1次，連續(xù)14 d。

1.3 AF持續(xù)時(shí)間測定 參照陳春林團(tuán)隊(duì)的建模方法[8]，實(shí)驗(yàn)第3、4、10、17天記錄給藥前后心電圖，以P波消失、f波出現(xiàn)為AF發(fā)生標(biāo)志；竇性心律恢復(fù)、P波復(fù)現(xiàn)、f波消失為AF終止標(biāo)志，AF發(fā)生至終止所持續(xù)的時(shí)間即為AF持續(xù)時(shí)間。

1.4 大鼠心房有效不應(yīng)期(ERP)測定 實(shí)驗(yàn)第18天，脫頸法處死SD大鼠后，迅速開胸取出心臟，剪取左心房肌條固定于持續(xù)通以混合氣體(95%O2+5%CO2)的含有K-H液的浴槽，調(diào)節(jié)前負(fù)荷為1g，穩(wěn)定40 min，采用連續(xù)雙刺激法測定心房肌ERP。

1.5 大鼠心房肌細(xì)胞動(dòng)作電位時(shí)程(APD)測定 采用改良的酶解法分離出大鼠心房肌細(xì)胞，選取富有活力、靜止、桿狀、橫紋清晰的細(xì)胞，應(yīng)用電流鉗方法引發(fā)心肌細(xì)胞動(dòng)作電位，全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄復(fù)極50%時(shí)的動(dòng)作電位時(shí)程(APD50)、復(fù)極90%時(shí)的動(dòng)作電位時(shí)程(APD90)。

1.6 ELISA檢測大鼠心房肌組織膠原表達(dá) 剪取的心房組織剪碎后置于研缽中，加入1 mL 4 ℃預(yù)冷的PBS快速研磨至未見明顯的組織塊，2 000 min，離心10 min后取上清，按照試劑盒中的方法，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長下檢測并記錄各組OD值。

1.7 心房肌MAPK信號通路蛋白表達(dá) 提取心房組織總蛋白，使用BCA法蛋白定量后，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉封閉、分別用單克隆抗體P38(1∶500)、P- P38(1∶500)、MKP-1(1∶500)4 ℃孵育過夜、二抗(1∶1 000)室溫孵育1 h后ECL顯色照相。采用 Bio-Rad quantity one對目的條帶進(jìn)行半定量分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用t檢驗(yàn)、方差分析和q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠AF心電圖 大鼠尾靜脈注射乙酰膽堿-氯化鈣混合液1～2 s后即出現(xiàn)典型的AF心電圖(見圖1)。

2.2 DHA對大鼠AF持續(xù)時(shí)間的影響 CON組和DHA組尾靜脈注射0.9%氯化鈉溶液，給藥前后心電圖無明顯變化，未見典型AF心電圖。AF組和DHA+AF組通過觀察心電圖，結(jié)果顯示隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的增加，AF大鼠的AF持續(xù)時(shí)間逐漸延長，實(shí)驗(yàn)第4、10、17天，與AF組相比，DHA+AF組大鼠AF持續(xù)時(shí)間明顯縮短(P<0.05～P<0.01)(見表1)。

表1 AF組與DHA+AF組大鼠AF持續(xù)時(shí)間比較

2.3 DHA對大鼠心房肌ERP影響 與CON組大鼠相比，AF組ERP明顯縮短，DHA組及DHA+AF ERP組延長(P<0.01)；與AF組相比，DHA+AF組大鼠ERP明顯延長(P<0.01)(見表2)。

表2 各組大鼠心房肌ERP比較

2.4 DHA對大鼠心房肌細(xì)胞APD影響 與CON組相比，AF組大鼠心房肌細(xì)胞APD50和APD90明顯縮短(P<0.01)，DHA組與DHA+AF組延長(P<0.01)；與AF組相比，DHA+AF組大鼠心房肌細(xì)胞APD50和APD90延長(P<0.01)(見表3、4)。

表3 DHA對大鼠心房肌細(xì)胞APD50的影響

表4 DHA對大鼠心房肌細(xì)胞APD90的影響

2.5 DHA對大鼠心房肌膠原表達(dá)影響 與CON組相比，AF組Ⅰ型、Ⅲ型膠原表達(dá)明顯增高(P<0.01)，DHA組Ⅰ型、Ⅲ型膠原表達(dá)明顯降低(P<0.01)；與AF組相比，DHA、DHA+AF組Ⅰ型、Ⅲ型膠原表達(dá)均明顯降低(P<0.01)(見表5、6)。

表5 DHA對大鼠心房?、裥湍z原表達(dá)的影響

表6 DHA對大鼠心房?、笮湍z原表達(dá)的影響

2.6 DHA對大鼠心房肌MAPK信號通路蛋白表達(dá)影響 各組P38表達(dá)無明顯變化，與CON組相比，DHA組P-P38表達(dá)明顯下降，MKP-1表達(dá)明顯增加(P<0.01)；AF組P-P38表達(dá)明顯增高，MKP-1表達(dá)明顯降低(P<0.01)；與AF組相比，DHA+AF組P-P38表達(dá)明顯下降，MKP-1表達(dá)明顯增加(P<0.01)(見表7、8)。

分組P-P38/P38FPMS組內(nèi)CON組0.60±0.05##AF組DHA組0.82±0.04**▲▲0.56±0.46## 3.03 <0.05 0.054DHA+AF組 0.71±0.03**##▲▲

項(xiàng)目分組MKP-1/β-actinFPMS組內(nèi)CON組0.70±0.06##▲▲AF組DHA組0.46±0.04**▲▲0.87±0.06**##125.90 <0.01 0.003DHA+AF組 0.75±0.05##▲▲

3 討論

AF是一種進(jìn)行性、自我持續(xù)性心律失常，AF及其并發(fā)癥成為一個(gè)日益嚴(yán)重的臨床問題[9]。本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制AF模型發(fā)現(xiàn)：與CON組相比，AF組大鼠AF持續(xù)時(shí)間隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間增加而逐漸延長，心房ERP、APD50及APD90明顯縮短，心房組織P-P38蛋白、Ⅰ型及Ⅲ型膠原表達(dá)水平明顯升高，MKP-1表達(dá)下降；DHA干預(yù)組AF持續(xù)時(shí)間較AF組明顯縮短，以實(shí)驗(yàn)第10、17天尤為顯著，在有效延長心房ERP、APD50及APD90的同時(shí)還下調(diào)了P-P38、Ⅰ型及Ⅲ型膠原表達(dá)水平，而MKP-1水平較前增加。這些結(jié)果表明，DHA可能通過調(diào)控P38 MAPK通路發(fā)揮抗AF作用。

AF的一個(gè)顯著特征是心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)，而心房纖維化的形成是導(dǎo)致AF病人心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的主要因素之一。研究證實(shí)[10]，ECM參與了心房重塑過程，心臟成纖維細(xì)胞分泌的膠原在ECM的形成中起著關(guān)鍵作用。多種膠原在ECM中表達(dá)并參與促纖維化反應(yīng)，Ⅰ型膠原約占心肌膠原的80%～90%，Ⅲ型膠原則與AF復(fù)發(fā)率獨(dú)立相關(guān)，當(dāng)組織受到刺激時(shí)，心肌成纖維細(xì)胞過度增殖，各型膠原合成和分泌增加，降解減少，發(fā)生膠原過度聚集，即ECM重構(gòu)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，與CON組相比，AF組大鼠Ⅰ型、Ⅲ型膠原表達(dá)明顯增高，提示AF的發(fā)生伴隨著心肌纖維化程度加重；與AF組相比，給予DHA治療后，大鼠心房Ⅰ型、Ⅲ型膠原表達(dá)顯著降低，提示DHA可通過改善膠原成分比例減輕纖維化，抑制心房重構(gòu)。

2009年的一項(xiàng)研究[11]表明，魚油補(bǔ)充劑中的DHA不僅有助于健康人群的心血管疾病預(yù)防，而且可減少心臟病病人的心臟事件和死亡率。近年來，DHA在防治AF方面的作用日益受到關(guān)注。流行病學(xué)隨訪研究發(fā)現(xiàn)，膳食魚類的人群與AF的低發(fā)病率密切相關(guān)[12],RAMADEEN等[13]在狗的AF模型中的研究發(fā)現(xiàn)DHA可以降低心房纖維化的程度進(jìn)而抑制AF的發(fā)生、發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通過DHA干預(yù)可顯著縮短AF持續(xù)時(shí)間，還可有效延長心房ERP、APD50及APD90，降低Ⅰ型、Ⅲ型膠原表達(dá)，與RAMADEEN等的結(jié)果一致，提示DHA可有效減輕AF大鼠心肌纖維化。

MAPKs是細(xì)胞內(nèi)的一類絲氨酸和(或)蘇氨酸激酶，是細(xì)胞應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的主要信號通路，MAPK的活性受MKP負(fù)調(diào)控，MKP-1缺乏可導(dǎo)致應(yīng)激反應(yīng)中P38 MAPK通路活化增強(qiáng)[14]。在小鼠肌少癥肥胖模型中發(fā)現(xiàn)，多不飽和脂肪酸對P38 MAPK信號通路所介導(dǎo)的骨骼肌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞分化減少有保護(hù)作用[15]。相關(guān)研究[16]顯示，多不飽和脂肪酸在保護(hù)心肌缺血再灌注損傷中具M(jìn)APK-1依賴性。有實(shí)驗(yàn)[17]證明，P38 MAPK的激活可顯著增加AF的易感性。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與CON組相比，DHA處理組P-P38表達(dá)明顯下降，MKP-1表達(dá)明顯增加(P<0.05)；與AF組相比，DHA+AF組P-P38表達(dá)明顯下降，MKP-1表達(dá)明顯增加。心房肌組織P38 MAPK 活性的逐漸增高與MKP-1 表達(dá)相對下降呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，這與文獻(xiàn)[14]中報(bào)道的一致。本研究發(fā)現(xiàn)，在各組大鼠中，P-P38蛋白的表達(dá)與Ⅰ型、Ⅲ型膠原表達(dá)趨勢一致，提示DHA不僅降低了P38的表達(dá)，還可降低Ⅰ型、Ⅲ型膠原表達(dá)，結(jié)合我們課題組前期研究[18]，本實(shí)驗(yàn)中DHA 可改善AF心房肌纖維化，其機(jī)制可能與激活P38 MAPK通路密切相關(guān)。

值得注意的是，心房重構(gòu)包括了結(jié)構(gòu)重構(gòu)和電重構(gòu)，后者[19]主要指AF時(shí)節(jié)律快而不規(guī)則的心房激動(dòng)造成的心房組織電生理特性的改變，常表現(xiàn)為ERP和APD一致性縮短。本實(shí)驗(yàn)中，與CON組大鼠相比，AF組大鼠ERP、APD50及APD90均表現(xiàn)為同步縮短，使用DHA干預(yù)后ERP、APD50及APD90均得到一致有效延長，提示DHA可能還發(fā)揮對抗AF大鼠的心房電重構(gòu)作用，其具體作用機(jī)制有待下一步深入研究。關(guān)于P38 MAPK通路與DHA的攝入鮮有報(bào)道，本研究初步證明DHA具有抗心房纖維化作用，該作用的實(shí)現(xiàn)可能與P38 MAPK通路調(diào)控的膠原表達(dá)有關(guān)，將為AF病人臨床治療的研究提供新的方向，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。