LSA-10型大孔樹脂分離恒山黃芪總黃酮的吸附動力學

劉 瑞， 張弘弛*， 魏新宇， 李 慧， 周 鳳

(1.山西大同大學生命科學學院, 大同 037009； 2.山西大同大學應用生物技術研究所， 大同 037009)

恒山黃芪(Astragalusmembranaceus)，屬于豆科黃芪屬的蒙古黃芪，主產于山西北部，尤其以北岳恒山所在的渾源縣為最佳[1-2],當地也將其稱為“正北芪”。恒山黃芪藥用歷史悠久，有“補藥之長”之稱，為歷代中醫最常用的中藥之一，其化學成分主要是多糖、三萜、黃酮等，其中恒山黃芪的總黃酮含量豐富，具有增加人體的免疫力和抵抗力、保護肝臟、抗腫瘤、抗病毒、糖尿病、延緩衰老等生理活性[3-5]。

傳統的黃酮類天然藥物的提取方式主要是堿提酸沉法和乙醇提取法[6-7]。但傳統方式有著提取率低、成本高、資源浪費的弊端。20世紀末發展起來的新型高分子吸附劑——大孔吸附樹脂，是一類不含交聯基團的多孔性交聯聚合物[8]，具有理化性質較為穩定、不溶于酸堿或其他有機溶劑、吸附速度快、穩定性好、生產周期短、成本低等優點[9]，在工業生產中具有廣闊的應用前景，在許多具有重要藥理作用的天然產物分離，特別是黃酮類化合物的純化中得到了廣泛的應用[10]。

目前，恒山黃芪總黃酮的研究和開發很少，對于黃芪黃酮的提取材料，中國研究主要集中于甘肅黃芪和蒙古黃芪。對于恒山黃芪總黃酮的提取沒有文獻報道，故在綜合分析文獻的基礎上，經過樹脂的篩選，確定LSA-10型大孔樹脂作為恒山黃芪總黃酮的分離介質。在LSA-10型大孔樹脂分離黃芪總黃酮的吸附動力學研究基礎上，探討LSA-10型分離恒山黃芪總黃酮的工藝，以期為規模化工業的應用奠定理論基礎。

1 儀器與材料

1.1 試劑和藥品

黃芪根(粉碎后試驗，山西渾源萬生黃芪開發有限公司)，樹脂XSA-5B、XDA-1、XSA-5、XSA-40、XDA-4、LSA-10、D101(國藥集團化學試劑有限公司)，蘆丁對照品(批號：V0038-201606，都萊生物試劑公司)，其余試劑(國藥集團化學試劑廠，分析純)。

1.2 儀器

T650CT型雙頭恒溫超聲波提取機(上海左樂儀器有限公司)；UV1600紫外分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)；GW-D型搖床(常州市國旺儀器制造有限公司)。

2 實驗方法

2.1 黃芪總黃酮的提取和濃度測定

準確稱取10 g黃芪粉末，轉入150 mL的三角瓶中，加入100 mL 無水乙醇，搖勻，室溫下浸提10 h，然后在超聲波提取機(提取功率500 W，時間30 min)中提取，重復3次操作，合并提取液，常溫，5 000 r/min離心10 min，收集上清液，待用。按照文獻[5]的方法，測定黃芪總黃酮濃度。

2.2 靜態吸附和解吸實驗

2.2.1 不同樹脂的靜態吸附和解吸性能測試

精確稱取干燥的XSA-5B、XDA-1、XSA-5、XSA-40、XDA-4、LSA-10、D101型大孔樹脂0.5 g，分別置于150 mL的三角瓶內，各加入50 mL黃酮提取液，于25 ℃下在搖床上以120 r/min振蕩12 h。將吸附平衡后的樹脂取出，過濾，測定吸附平衡后溶液中總黃酮的濃度，用來計算吸附量；之后再用去離子水清洗濾出的樹脂，加入80%的乙醇溶液50 mL，設定溫度為25 ℃，在搖床上以120 r/min振蕩12 h進行解吸，過濾，得解吸液，測定解吸液中總黃酮的濃度，計算解吸量。計算公式為

(1)

(2)

(3)

式中：Qe為干樹脂的吸附能力即每克干樹脂吸附黃酮的質量，mg/g；Qd為每克干樹脂的解吸量，mg/g；D為解吸率，%；C0為每毫升黃酮提取液的初始濃度，mg；V0為黃酮樣品液的初始體積，mL；Ce為吸附平衡后黃酮的濃度，mg/mL；Cd為解吸液的濃度，mg/mL；Vd為解吸液的體積，mL；W為樹脂的干質量，g。

2.2.2 所選樹脂上的吸附動力學測試

將50 mL樣品溶液加入到150 mL的三角瓶中(含所選大孔樹脂0.5 g)，在搖床上以25 ℃、120 r/min振蕩，每30 min測試吸附液中總黃酮的濃度，直到達到吸附平衡，得到吸附動力學曲線。通過擬一階和擬二階模型[10-11]的適用性，預測黃芪總黃酮在所選樹脂的吸附過程。擬一階和擬二階模型表達式為

(4)

(5)

式中：Qt為t時刻每單位質量吸附劑中溶質的濃度，mg/g；k1和k2為擬一階和擬二階速率常數。設定初始條件為t=0，Qt=0時，兩個動力力學方程具有解析解，即

(6)

(7)

2.2.3 所選樹脂的吸附等溫線測試

將50 mL不同濃度樣品溶液加入到150 mL的三角瓶中(含所選大孔樹脂0.5 g)，分別在15、25、35 ℃的條件下，以120 r/min在搖床上振蕩12 h，檢測達到平衡后的濃度，對Freundlich和Langmuir模型進行適應度評估。用這一方法來確定所選樹脂對于黃芪提取物的吸附等溫線。溶液中的總黃酮濃度分別設定為：0.916、1.338、2.725、3.247、4.728 mg/mL。

Langmuir方程[12]模型的數學表達式為

(8)

式(8)中：KL為Langmuir 相關系數；Qm為理論上的最大吸附能力。將Langmuir 方程轉化為以Ce和Ce/Qe為橫縱坐標的線性形式為

(9)

Freundlich模型[13]是一種雙參數模型，廣泛應用于許多不同的吸附劑/吸附體系的氣相和液相吸附。

Freundlich方程模型的數學表達式為

(10)

線性形式的Freundlich方程可以表示為

(11)

式(11)中：KF為反映樹脂吸附能力的Freundlich 常數；1/n為與吸附驅動力大小相關的經驗常數。由截距可以得到KF的值，由斜率可以得到1/n的值，最后由lnCe和lnQe可以得到線性回歸直線。

2.3 動態吸附和解吸測試

2.3.1 上樣濃度的優化

前期試驗表明，上樣流速恒定的條件下，上樣濃度與泄漏點呈現正相關，所以選擇樹脂柱徑高比為1∶8，上樣流速1 mL/min，設置 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mg/mL不同上樣濃度考察動態吸附，計算出不同上樣濃度的吸附量和吸附率，確定最佳上樣濃度；在最佳上樣濃度下，測定動態泄露曲線，確定最佳上樣體積。

2.3.2 上樣流速的優化

前期試驗表明，黃芪的黃酮提取液在LSA-10型樹脂的吸附較慢，所以篩選工藝選擇樹脂柱徑高比為1∶8，已篩選的上樣濃度0.5 mg/mL，設置1、2、3、4 mL/min的流速，考察動態吸附，測定流出液的黃酮濃度，繪制吸附曲線，確定最佳的上樣流速。

2.3.3 洗脫液濃度的優化

選擇樹脂柱徑高比為1∶8，上樣濃度0.5 mg/mL，上樣流速2 mL/min，用30%、40%、50%、60%、70%、80%的1 BV(bed volume，床體積)的乙醇溶液進行淋洗，控制流速為1.0 BV/h。測定所得液體中黃酮的濃度，選出最佳的洗脫液濃度。

2.3.4 洗脫液流速的優化

相同的裝柱和上樣步驟，用60%的乙醇溶液淋洗，分別控制洗脫液流出的速度為1.5、2、3、4 BV/h，將洗脫液按照每份5 mL進行收集，記錄流出的液體中黃酮的濃度，計算解吸量，確定最佳洗脫液流速。

2.3.5 洗脫液體積的優化

相同的裝柱和上樣步驟，用洗脫液洗脫，分段收集流出液，每份5 mL，測定流出的液體中黃酮的濃度，得出解吸量，確定最佳洗脫液體積。

3 結果與分析

3.1 蘆丁標準曲線

蘆丁標準曲線如圖1所示，通過線性回歸得到標準方程為

圖1 蘆丁標準曲線Fig.1 Standard curve of rutin

Y=-0.004 7+0.580 5X，R2=0.998 19。

3.2 吸附和解吸能力以及解吸率

樹脂的吸附和解吸能力取決于它的三維空間立體結構，特別是取決于其平均孔隙直徑、比表面積和極性。吸附和解吸的結果如圖2所示。從圖2中可以看出，LSA-10型樹脂相比于其他樹脂具有更好的吸附和解吸性能，因此選擇 LSA-10型樹脂作為后續實驗的樹脂。

3.3 LSA-10樹脂的吸附動力學

接觸時間是決定吸附作用的另一個重要的因素。為了評價接觸時間對吸附性能的影響，得出了黃酮在 LSA-10型樹脂上的吸附動力學曲線，如圖3所示，LSA-10樹脂吸附量在90 min左右達到平衡。因此，將吸附時間設定為90 min。“lg(Qe-Qt)與t”和“t/Qt與t”的關系曲線如圖3(a)和圖3(b)所示。從這些曲線的斜率計算出k1和k2的值。可以得出以下方程：

擬一階方程：lg(Qe-Qt)=-0.000 9t+1.32；

擬一階和擬二階動力學模型的相關系數(R2)分別為0.96和0.985[圖3(a)和圖3(b)]。因此，用擬二階動力學模型偏差較小，適合用于解釋黃酮在 LSA-10型樹脂的吸附情況。

圖3 黃酮在LSA-10型樹脂上的吸附動力學曲線Fig.3 Adsorption kinetic curve of flavonoids on LSA-10 resin

3.4 吸附等溫線

為了研究總黃酮在LSA-10型樹脂上的吸附能力，并且表征其吸附行為，提取了不同濃度總黃酮(0.916、1.338、2.725、3.247、4.728 mg/mL)的溶液，用LSA-10型樹脂分別在15、25、35 ℃ 下振蕩，達到吸附平衡。可以得到等溫線如圖4(a)所示。從圖4(a)可知:在研究溫度范圍內，相同的初始濃度條件下，25 ℃時吸附能力最好，因此，選擇最適合工業化生產的溫度25 ℃。圖4(b)和圖4(c)所示為基于Langmuir和Freundlich模型對總黃酮的實驗結果的模擬擬合的結果。

圖4 在15、25、35 ℃ 下LSA-10型樹脂對于總黃酮的吸附等溫線Fig.4 Adsorption isotherms on LSA-10 resin at 15, 25, 35 ℃ for total flavonoids

溫度不同時，Langmuir和Freundlich方程的參數如表1和表2所示。LSA-10型樹脂上總黃酮的Langmuir和Freundlich方程的相關系數(R2)分別0.99和0.95。高相關系數表明，Langmuir等溫吸附方程模型適用于描述所研究濃度范圍內被測吸附體系。

表1 在不同溫度下LSA-10樹脂上總黃酮的Langmuir參數Table 1 Langmuir parameters of LSA-10 resin at different temperatures

表2 在不同溫度下LSA-10樹脂上總黃酮的Freundlich參數Table 2 Freundlich parameters of LSA-10 resin at different temperatures

3.5 上樣液濃度的確定

由圖5可以看出，上樣濃度越高，吸附力越低，吸附量越高。當上樣濃度小于等于0.5 mg/mL時，吸附率高于80%，滿足吸附要求，同時考慮到上樣液濃度為 0.5 mg/mL時吸附量較大，因此，選擇上樣濃度為0.5 mg/mL。由圖6可知，隨著黃芪提取液上樣體積的增加，流出液中的總黃酮的濃度也在不斷增加，吸附率會逐漸降低，當流出液收集至4 BV時，洗脫液中黃酮的濃度迅速增加，表明此時已經達到泄漏點(流出液中黃酮濃度占上樣液中黃酮濃度的百分比為泄漏率，當泄漏率為10%時即為泄漏點)，因此，選擇上樣體積為4 BV。

圖5 不同上樣濃度對黃酮吸附率及吸附量的影響Fig.5 Effect of sample solution concentration on adsorption rate and total adsorption amount

圖6 上樣濃度0.5 mg/mL時，黃芪總黃酮在LSA-10型樹脂上的動態泄露曲線Fig.6 Dynamic leakage curve of total flavones of astragalus on LSA-10 resin at the loading concentration of 0.5 mg/mL

3.6 上樣流速的確定

當上樣流速為1、2、3 mL/min時，泄漏點出現較晚，上柱體積分別為5、4、5 BV；而流速為4 mL/min時泄漏點出現較早，在2 BV(圖7)。上樣流速越快，泄漏點出現越早，原因可能是流速加快，溶質分子未及擴散到樹脂表面，就被流走，沒有完全進行吸附；而上樣流速越小，黃酮分子就有足夠的時間進行擴散和吸附，有利于吸附，但流速也不宜過慢，導致吸附周期延長，效率低，不利于實際生產。因而，確定后續實驗上樣流速為3 mL/min。

圖7 不同上樣流速時樹脂的動態吸附曲線Fig.7 Dynamic adsorption curve for different absorption flow rate of resin

3.7 洗脫液濃度的確定

當乙醇濃度達到80%時，流出液中總黃酮濃度明顯減少。因此，選擇乙醇濃度30%～80%的乙醇洗脫液進行常規優化，結果如圖8(a)所示。在乙醇濃度達到60%之前，洗脫能力有所提高；60%之后洗脫能力下降，因此在后續的實驗中以60%的乙醇水溶液作為洗脫劑。

3.8 洗脫液體積的確定

如圖8(b)所示，隨著洗脫液的用量增加，洗脫液中黃酮濃度提升，當洗脫液的消耗量達到7 BV時，洗脫液中黃酮濃度達到最大值，洗脫液的消耗量達到9 BV時，洗脫液中黃酮濃度銳減，因此為節約時間以及成本，選用8 BV洗脫劑來進行洗脫。

3.9 洗脫流速的確定

為了有效地從樹脂中解吸出黃酮，一個合適的流速是十分必要的。從圖8(c)中可以看出，當洗脫劑流速在2 BV/h時，洗脫液中總黃酮的解吸率較高，并且從工藝過程上來看更加經濟有效率。因此選擇洗脫流速為2 BV/h較為合適。

圖8 不同因素對LSA-10樹脂洗脫能力的影響Fig.8 Effect of different factors on elution capacity of LSA-10 resin

3.10 驗證實驗結果

經過三次驗證實驗，發現純化后總黃酮的純度提高到49.4 %。

4 討論

LSA-10大孔樹脂在天然藥物成分提取中的應用研究相對較少，主要集中在多糖和黃酮方面。Dong等[14]報道了LSA-10型大孔樹脂對芹菜素的吸附性能；韓鳳波等[15]對比分析了LSA-10型和LX-20B型大孔吸附樹脂純化玉竹多糖工藝；董文賓等[16]研究了LSA-10型樹脂純化大豆異黃酮工藝條件；雷雪等[17]以金絲桃素為指標，研究了LSA-10型大孔樹脂純化貫葉連翹提取物的工藝。本文研究發現，LSA-10型大孔樹脂對黃芪總黃酮也有很好的吸附作用，擴展了LSA-10型大孔樹脂在天然藥物成分提取中的應用范圍。

5 結論

(1)通過靜態吸附和解吸測試，優選了樹脂類型，確定了LSA-10型樹脂對于黃芪中總黃酮有著最佳的吸附特性。

(2)LSA-10型大孔吸附樹脂對黃芪中總黃酮分離的最佳條件是：黃芪提取液的上樣濃度0.5 mg/mL，上樣體積4 BV，上樣流速3 mL/min，以8 BV、60%乙醇以2 BV/h的速度進行洗脫。應用此工藝純化黃芪總黃酮，發現其純度提高到49.4%，解吸率達95.7%，LSA-10型大孔吸附樹脂適合用于黃芪總黃酮的富集分離。優化了上樣量、上樣流速、洗脫劑濃度、洗脫劑流速、洗脫劑用量等參數，大大提高了提取液中總黃酮的濃度。該方法具備低毒、低成本、高效、操作簡單等優點，將有助于解決黃芪中總黃酮的純化問題。