不同種類微生物對碳酸鹽巖溶蝕普遍性

齊義彬， 丁 茜， 朱東亞， 何治亮

(1.中國石油化工股份有限公司石油勘探開發(fā)研究院， 北京 100083； 2.中國石油化工股份有限公司， 北京 100728)

碳酸鹽巖在地殼中分布十分廣泛，約占沉積巖總面積的20%。據(jù)統(tǒng)計，世界上超過60%的油氣產(chǎn)量都是來自碳酸鹽巖儲層[1]。中國的海相碳酸鹽巖地層分布面積達300×105km2，具有良好的油氣勘探潛力[2]。而現(xiàn)階段油氣勘探實踐已經(jīng)表明，優(yōu)質(zhì)碳酸鹽巖儲層的形成是發(fā)育在有利沉積相帶的基礎(chǔ)上，受表生溶蝕、埋藏溶蝕和構(gòu)造運動等多種因素共同作用的結(jié)果[3]。

隨著研究的深入和發(fā)展，表生溶蝕中的生物巖溶在巖溶發(fā)育過程中的作用逐漸得到了重視。生物巖溶指的是生物參與的喀斯特作用，加速溶蝕或沉積過程與現(xiàn)象的總稱[4]。這一現(xiàn)象在巖溶區(qū)普遍發(fā)生，因生物活動生成大量二氧化碳，源源不斷地進入溶蝕作用系統(tǒng)，打破化學平衡，使溶蝕繼續(xù)，此外，生物活動還可以生成有機酸，增加溶蝕。國內(nèi)外研究者對生物巖溶的研究多集中在高等植物、地衣、藻類等方面，聶磊等[5]研究了表面藍藻對石灰?guī)r的巖溶侵蝕能力，王奇崗等[6]研究水生植物對碳酸鹽的巖溶作用。諸多研究揭示出地衣、藻類或高等植物覆蓋處的巖溶作用強烈，土壤持水性、土壤肥力、酶活性均好于裸露巖石。

而有關(guān)微生物的巖溶作用研究主要集中在沉積作用方面，寧卓等[7]研究了自養(yǎng)微生物代謝及誘導(dǎo)產(chǎn)生碳酸鹽巖沉淀作用，鐘福平等[8]研究了微生物和生物膜的鈣化引起碳酸鹽巖的沉淀作用。總體上，目前關(guān)于微生物對礦物的溶蝕研究雖然較多，但對碳酸鹽巖的溶蝕作用的研究較少，僅有少部分細菌對碳酸鹽溶蝕作用的研究[9]。而對于真菌和放線菌的溶蝕動態(tài)研究尚未見報道，而比較不同類群微生物(細菌、真菌和放線菌)的溶蝕作用效果將有助于評價不同種類微生物在生物巖溶中的作用和地位，為探索它們的溶蝕作用機理提供依據(jù)。

因此，研究注重從自然環(huán)境中篩選到3種不同類型的最具代表性的微生物(細菌、放線菌和真菌)，通過對其培養(yǎng)研究不同類型微生物對碳酸鹽巖溶蝕作用的普遍性，比較不同種類微生物溶蝕作用效果，并探討微生物在多孔介質(zhì)中的溶蝕作用，初步研究微生物溶蝕在表生巖溶中的作用。

1 實驗材料和方法

1.1 菌株

從自然環(huán)境的巖石表面中篩選到實驗用的細菌、放線菌和真菌，分別編號為Q1、Q2和Q3，經(jīng)鑒定，細菌Q1屬于芽孢桿菌屬，放線菌Q2屬于鏈霉菌屬，真菌Q3屬于曲霉菌屬。從生長代謝特點可以得知，這三種微生物均能夠在較為惡劣的巖溶環(huán)境中生長代謝[10-11]。

1.2 培養(yǎng)基

無機鹽+蔗糖培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖 2，Na2HPO41，KH2PO41，NaNO33，NH4Cl 1，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.1，CaCl20.1。pH 7.2。

高氏1號培養(yǎng)基(g/L)：可溶性淀粉 20，KNO31，K2HPO40.5，MgSO4·7H2O 0.5，CaCl20.1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01。pH 7.6。

以上培養(yǎng)基均溶于1 000 mL水中，121 ℃滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基(g/L)：稱取200 g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加1 000 mL水煮沸 30 min，再加20 g葡萄糖，紗布過濾，115 ℃滅菌15 min。

1.3 菌株培養(yǎng)

芽孢桿菌屬Q(mào)1、鏈霉菌屬Q(mào)2和曲霉菌屬Q(mào)3的發(fā)酵時間均為48 h，培養(yǎng)溫度為30 ℃，3種菌均以120 r/min振蕩培養(yǎng)，接種量為5%[12]。

將芽孢桿菌屬Q(mào)1、鏈霉菌屬Q(mào)2和曲霉菌屬Q(mào)3在斜面上劃線培養(yǎng)(30 ℃)24 h后，用無菌水將菌體洗下，調(diào)整菌體濃度值1×106CFU/mL的發(fā)酵液作為種子液備用。

1.4 碳酸鹽巖樣品

實驗所用方解巖和白云巖采自四川盆地野外剖面的純凈樣品，做成長0.5 cm、寬0.5 cm、高 0.5 cm 的正方形樣品，經(jīng)雙蒸水洗滌后烘干，滅菌備用。

1.5 微生物產(chǎn)酸能力分析方法

測定芽孢桿菌Q1、鏈霉菌Q2和曲霉菌Q3的產(chǎn)酸能力，分別配制無機鹽+蔗糖、高氏1號和PDA培養(yǎng)基，調(diào)整pH 7。將120 mL培養(yǎng)基置于250 mL三角瓶中，然后按照5%的比例分別接種Q1、Q2和Q3種子液，以120 r/min振蕩培養(yǎng)5 d，分別在不同時間檢測培養(yǎng)體系中pH變化。相同條件下不接種培養(yǎng)基為對照組[13]。

1.6 微生物對碳酸鹽巖溶蝕速率的分析方法

測定芽孢桿菌Q1、鏈霉菌Q2和曲霉菌Q3對方解巖和白云巖的溶蝕速率，分別配制無機鹽+蔗糖、高氏1號和PDA培養(yǎng)基，調(diào)整pH 7，將120 mL培養(yǎng)基置于250 mL三角瓶中，每瓶培養(yǎng)基中額外加入4塊方解巖或白云巖樣品，然后按照5%的比例分別接種Q1、Q2和Q3種子液，以120 r/min振蕩培養(yǎng)5 d，分別在不同時間收集樣品測定Ca2+濃度，計算白云石/方解石溶蝕速率，相同條件下不接種培養(yǎng)基為對照組[14-15]。

1.7 多孔介質(zhì)條件下微生物對碳酸鹽巖溶蝕分析方法

利用微生物物理驅(qū)油模型研究不同微生物在多孔介質(zhì)條件下對白云巖的溶蝕情況，將白云石粉末(100目)裝入填砂管中制作填砂管模型，巖心驅(qū)替模擬實驗裝置和巖心參數(shù)如圖1和表1所示。首先在巖心中注入菌株對應(yīng)的培養(yǎng)基，直到巖心中充滿營養(yǎng)，隨后分別向巖心中注入30%空隙體積(pore volume, PV)的微生物種子液，然后在30 ℃下培養(yǎng)28 d。最后測定巖心中Ca2+濃度和巖心滲透率的變化，對照組在相同的條件下用無機鹽培養(yǎng)基代替微生物懸浮液[16-17]。

表1 巖心參數(shù)表

圖1 巖心驅(qū)替模擬實驗裝置示意圖Fig.1 Core displacement experiment device

1.8 分析方法

分別用pH 4.0和pH 7.0的標準樣品校正雷磁

PHSJ-5型pH計，然后測定各培養(yǎng)體系的pH，每個樣品測3次，取平均值。采用離子色譜技術(shù)和電感耦合等離子體發(fā)射光譜技術(shù)分析各培養(yǎng)體系中Ca2+濃度[18-19]。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同種類微生物產(chǎn)酸的動態(tài)變化

各試驗組和對照組pH的變化如圖2所示，可以看出，各實驗體系中pH的變化呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，對照組的pH呈現(xiàn)輕微降低的趨勢是因為在振蕩的過程中溶解了空氣中的二氧化碳，而實驗組pH降低的特別明顯說明實驗中所使用的各種類型的微生物在生長代謝的過程產(chǎn)生了酸性物質(zhì)，但是不同種類的微生物對體系pH的影響程度明顯不同[20]。培養(yǎng)后芽孢桿菌Q1的菌濃達到了8.96×108CFU/mL，培養(yǎng)體系的pH降低了1.64；鏈霉菌Q2的菌濃達到了6.89×109CFU/mL，培養(yǎng)體系的pH降低了2.23；曲霉菌Q3的菌濃達到了9.83×109CFU/mL，培養(yǎng)體系的pH降低了2.69。由此可見，真菌在生長代謝過程中生長速率最快，產(chǎn)生的酸性物質(zhì)也最多，其次是放線菌，細菌最后。以上結(jié)果說明，自然與巖溶環(huán)境中的微生物在其生長代謝過程中能夠產(chǎn)生酸性物質(zhì)。這些酸性物質(zhì)一部分是微生物代謝產(chǎn)生的碳酸酐酶(CA)將代謝產(chǎn)生的二氧化碳轉(zhuǎn)化成碳酸[21]，另一部分是微生物在代謝循環(huán)過程中會形成有機酸(丙酮酸、延胡索酸等)[22]。

圖2 微生物培養(yǎng)過程中pH變化Fig.2 Change of pH in microbial system culture

2.2 不同種類微生物對碳酸鹽巖溶蝕的動態(tài)變化

各實驗組和對照組Ca2+濃度的動態(tài)變化如圖3所示，可以看出，培養(yǎng)120 h后，芽孢桿菌Q1-方解巖和芽孢桿菌Q1-白云巖培養(yǎng)體系中Ca2+濃度分別達到了171 mg/L和133 mg/L；鏈霉菌Q2-方解巖和鏈霉菌Q2-白云巖培養(yǎng)體系中Ca2+濃度分別達到了198 mg/L和166 mg/L；曲霉菌Q3-方解巖和曲霉菌Q3-白云巖培養(yǎng)體系中Ca2+濃度分別達到了 327 mg/mL 和258 mg/L；這說明實驗所用的典型細菌、真菌和放線菌均對方解巖和白云巖有明顯溶蝕作用，其中真菌的溶蝕效果最顯著，明顯高于鏈霉菌和細菌培養(yǎng)體系。而這些結(jié)果又與3種微生物產(chǎn)酸動態(tài)情況相符[23]。

圖3 微生物-碳酸鹽巖培養(yǎng)體系中Ca2+濃度變化Fig.3 Changes of Ca2+ concentration in microbial-carbonatite culture system

對于不同類型碳酸鹽巖，微生物對其溶蝕速率也有所不同，微生物對方解石的溶蝕比對白云巖溶蝕釋放出更多的Ca2+，以上結(jié)果說明在相同的微生物培養(yǎng)條件下，方解巖的溶蝕速率明顯要快于白云巖[24]。

2.3 微生物巖心驅(qū)替溶蝕實驗結(jié)果

多孔介質(zhì)條件下微生物對碳酸鹽巖溶蝕情況結(jié)果如表2所示，可以看出，在選用的白云巖巖心的孔隙度和滲透率都接近的條件下，微生物在多孔介質(zhì)中培養(yǎng)后，滲透率均明顯增加了，而且溶液中Ca2+濃度明顯升高。具體來看，芽孢桿菌Q1的巖心滲透率增加了51.7×10-3μm2，鏈霉菌Q2的巖心滲透率增加了66.2×10-3μm2，曲霉菌的巖心滲透率增加了89.1×10-3μm2。同時各實驗組中Ca2+濃度也明顯升高，分別達到了132.4、154.5、207.4 mg/L。以上結(jié)果說明，這3種微生物均能夠在多孔介質(zhì)中代謝酸性物質(zhì)溶蝕白云巖，真菌Q3溶蝕速率最快，放線菌Q2次之，細菌Q1溶蝕速率較慢；同時，微生物除了在巖石表面產(chǎn)生溶蝕作用，在合適的多孔介質(zhì)巖心中也能夠?qū)μ妓猁}巖等產(chǎn)生溶蝕作用。這表明，微生物巖溶很有可能發(fā)生在較大表層巖石范圍內(nèi)，微生物巖溶在表生巖溶中起重要作用[25]。

表2 白云巖巖心溶蝕實驗結(jié)果

3 結(jié)論

(1)從巖石表面中篩選到最常見的芽孢桿菌Q1、鏈霉菌Q2和曲霉菌Q3，這3種微生物在生長代謝過程中均能夠產(chǎn)生酸性物質(zhì)，降低培養(yǎng)體系的pH。

(2)這3種微生物均能夠溶蝕方解巖和白云巖，提高環(huán)境中Ca2+濃度，但不同種屬的微生物的溶蝕速率存在差別，曲霉菌Q3溶蝕速率最快，細菌Q1最慢；同時，這3種微生物對方解巖的溶蝕能力明顯強于白云巖。

(3)多孔介質(zhì)培養(yǎng)實驗證明，微生物除了對碳酸鹽巖表面產(chǎn)生溶蝕作用，在多孔介質(zhì)巖心中也能夠?qū)μ妓猁}巖等產(chǎn)生溶蝕作用。

(4)微生物對碳酸鹽巖溶蝕作用具有普遍性，微生物巖溶很有可能發(fā)生在較廣泛的表層巖石范圍內(nèi)，是碳酸鹽巖儲層形成的重要因素之一。