二級出水中抗生素抗性基因存在形態及質粒接合轉移影響因素

孫麗華, 朱珺瑤, 陽兵兵, 劉燁輝, 高 呈, 馮萃敏

(1.北京建筑大學城市雨水系統與水環境教育部重點試驗室， 北京 100044； 2.北京建筑大學環境與能源工程學院， 北京 100044； 3.金融街控股股份有限公司， 北京 100032)

抗生素被廣泛應用于醫療和養殖領域，可以防治人類的傳染病，預防動物疾病并促進動物生長[1]。然而人體或動物并不能完全吸收進入體內的抗生素，導致大量的抗生素通過糞便進入環境[2]，誘導和選擇出抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes，ARGs)[3]。近年來，在土壤、地表水、地下水、污水甚至飲用水中都檢出了大量的ARGs[4-5]。城市污水廠是人類生產生活產生抗生素的聚集地，近年來已在很多污水廠進水中檢測到ARGs[6]。然而傳統污水處理系統雖可有效控制耗氧有機物、氨氮和總氮等污染物，但對ARGs的控制效果相對有限[7]，使得污水廠的二級出水中仍含有大量ARGs。

ARGs主要通過親代遺傳和水平轉移兩種途徑傳播。其中，水平轉移是ARGs傳播的重要方式，利用可移動的遺傳因子，如質粒、轉座子、整合子等，通過接合、轉化、轉導等方式將ARGs從一種細菌轉移到另一種細菌中，從而使細菌獲得ARGs[8]。有研究表明[9]，大多數ARGs位于質粒上，只有少部分位于染色體上，并且質粒所具備的自我復制特性，使得接合轉移成為ARGs水平轉移中發生頻率最高、最主要的轉移方式。Lu等[10]研究了納米銀和Ag+對ARGs接合轉移的影響，發現環境中亞致死濃度下可以促進ARGs的接合轉移。Zhang等[11]通過對特定菌株的探究，發現3種消毒劑在次抑制濃度下可促進同種屬和不同種屬細菌間的接合轉移。上述研究說明外界因素會影響ARGs的接合轉移，但環境因素對質粒轉移的影響程度如何，中外尚未見報導。深入探究接合轉移的影響因素有助于提出緩解ARGs水平轉移的方案。

現主要對某典型污水廠二級出水中ARGs的相對分子質量分布和主要存在形態進行分析，并考察環境因素(接合時間、溫度、pH等)對抗性質粒接合轉移的影響。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗選取北京市某污水廠二級出水為實驗原水，水樣取回后迅速放于4 ℃冰箱中低溫存儲。膜分級實驗采用進口平板超濾膜(Millipore，USA)，材質為再生纖維(RC)。ARGs接合實驗采用上海生物工程有限責任公司的硫酸卡那霉素(KAN)、氯霉素(CHI)篩選雙抗(KAN+CHI)接合子。接合轉移質粒為pHS-AVC-LW1144，由北京合生基因有限公司構建，攜帶硫酸卡那霉素(KAN)抗性，對該質粒進行改造，添加紅色熒光蛋白(red fluorecent protein， RFP)元件，熒光波長為584 nm，將改造后的質粒導入供體菌內，成功表達后顯紅色。供菌體選用S17-1 lamp pir大腸桿菌；受體菌選用MG1655-chl大腸桿菌，屬于工程改造菌株系列(K12)，攜帶氯霉素(CHI)抗性；供菌體和受菌體均由北京合生基因有限公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 膜分級實驗

膜分級實驗采用400 mL的Millipore小型平板膜超濾杯(model8400, Amicon Corp)對水樣進行過濾，分級所用的膜截留相對分子質量分別為100、30、10、3、1 kDa；ARGs含量采用ABI PRISM7900型號實時熒光定量(real-time quantitative polymerase chain reaction，qPCR)(ABI Co.，美國)進行檢測；質粒接合轉移現象采用型號為FV1000的激光共聚焦顯微鏡(Olympuus Co.，日本)進行檢測。

1.2.2 水中ARGs存在形態實驗

實驗過程中采用DNA溶解酶對水中游離態ARGs進行消除，在500 mL水樣中加入1 mg DNA溶解酶顆粒，經2 h恒溫(25 ℃)水浴振蕩，之后在80 ℃水中加熱10 min，水樣冷卻后用0.22 μm膜片截留水中物質，進行qPCR定量檢測，得到細胞態的ARGs濃度情況。水樣中游離態ARGs含量為ARGs總量與細胞態ARGs含量的差。

1.2.3 ARGs接合轉移實驗

實驗中將供體菌(S17-1 lamp pir)和受體菌(MG1655-chl)分別接種在含有卡那霉素和氯霉素的LB(Luria-Bertan)肉湯培養基中37 ℃靜置培養活化，然后進行ARGs接合轉移實驗。

(1)將活化后供、受體菌液離心(2 000g)10 min，然后用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌菌液，去除上清液，洗滌三次，最后用LB培養基重新懸浮菌種，并調整OD600=0.4(菌種濃度大致為108CFU/mL)。

(2)分別取2.5 mL供體菌、受體菌混合搖勻進行接合轉移實驗，在37 ℃ LRH-250型的恒溫培養箱(上海一恒科技有限公司，中國)中靜置培養16 h。

(3)取混合菌液搖勻，以10倍梯度稀釋法將混合菌液涂布在含KAN+CHI雙抗性的LB瓊脂固體培養基上，然后放置于37 ℃恒溫培養箱中靜置培養16 h。

(4)統計LB瓊脂培養基上紅斑菌種生長情況，并計算接合子數量。

2 實驗結果與討論

2.1 二級出水中ARGs的相對分子質量分布

研究ARGs相對分子質量分布實驗中，采用5種不同截留相對分子質量(100、30、10、3、1 kDa)的超濾膜對水樣進行依次截留，檢測膜片上的ARGs濃度[c(ARGs)]，得到不同相對分子質量區間的ARGs絕對豐度，分析ARGs在各個相對分子質量區間范圍的濃度情況以及各區間的濃度百分比，為了能直觀地對比不同的ARGs濃度情況，將得出的結果以log值記，即各個ARGs的濃度數量級，結果如圖1與表1所示。

圖1 二級出水中ARGs在各相對分子質量區間的濃度分布Fig.1 Concentration distribution of antibiotic resistance genes in molecular weight range of the secondary effluent of sewage treatment plant

表1 二級出水中ARGs在各相對分子質量區間濃度百分比Table 1 Concentration percentage of antibiotic resistance genes in secondary effluent in each molecular weight range

如圖1所示，從原水中ARGs總量可知，截留的tetX、sulI與轉移元件Ⅰ類整合子(intI1)的濃度較高，其log值分別為7.11、7.70、7.81，tetA、tetC、tetG和sulⅡ的濃度log值為5.56～6.24，而16S rRNA的濃度log值達到9.36。結果表明，污水處理廠的二級出水中仍含有濃度較高的ARGs，這也表明了傳統的污水處理工藝無法有效去除污水中含有的ARGs[12]。同時，二級出水中還含有較高濃度的Ⅰ類整合子和細菌數量，有研究表明高濃度的Ⅰ類整合子和細菌數量會促進水中ARGs的轉移擴散[13-14]。

圖1和表1結果顯示，在10～30 kDa、3～10 kDa和1～3 kDa區間膜片上所截留的ARGs含量很低，表明ARGs在該區間分布較少；在30～100 kDa區間發現，tetA、tetC、tetG、sulI、sulⅡ、intI1和16S rRNA在此區間的濃度百分比分別為0.5%、3.6%、3.7%、1.2%、2.1%、0.8%和0.2%，而tetX占總量的36.0%，大于其他ARGs在這一區間的濃度比例，這是因為tetX是編碼合成一個具有388個氨基酸、相對分子質量為46.7 kDa的蛋白[15]，在30～100 kDa區間；在大于100 kDa相對分子質量區間ARGs的濃度較高，tetA、tetC、sulI、intI1和16S rRNA濃度占膜片上各ARGs總量的90%以上，tetG和sulⅡ在此區間的濃度百分比分別為85.3%與85.1%，tetX在此區間占56.5%，二級出水中的ARGs主要分布在大于100 kDa區間，由此說明ARGs的相對分子質量大小主要分布在大于100 kDa范圍，且由于部分ARGs吸附在水中大分子有機物的表面，提高了膜片對ARGs截留作用[16]，所以在100 kDa膜片上截留的ARGs濃度高。

2.2 二級出水中細胞態和游離態ARGs濃度分布

實驗采用DNA溶解酶對水中游離態ARGs進行消除，確定二級出水中ARGs的存在形態，結果如圖2所示。

圖2 二級出水中細胞態與游離態ARGs濃度Fig.2 Concentration antibiotic resistance genes of cell-associated and cell-free

結果表明，水中細胞態和游離態tetA濃度差別不大，其log值分別為6.12和6.15；其他ARGs(tetG、tetC、tetX、sulI、sulⅡ)、intI1以及16S rRNA的濃度差異明顯，均呈現游離態多于細胞態的規律。這是由于細胞態ARGs主要存在于懸浮污泥中，經生化深度處理后細胞破碎裂解，釋放游離的攜帶ARGs的DNA片段[17]，使得二級出水中游離態的ARGs含量更高。張明美[18]研究表明，游離態的ARGs較細胞態更加難以去除，并且還可在環境中持久存在。所以，控制二級出水中游離態ARGs是降低ARGs傳播與轉移的重要措施。

2.3 水環境中質粒的接合轉移過程及其影響因素

2.3.1 質粒在細菌間的接合轉移現象

為探究ARGs水平轉移的過程，將攜帶卡那霉素(KAN)抗性的接合轉移質粒pHS-AVC-LW1144添加紅色熒光RFP元件，并將該質粒導入到供體菌S17-1 lamp pir大腸桿菌內，在激光共聚焦顯微鏡下觀察活性大腸桿菌的情況，實驗結果如圖3所示。

圖3 抗性質粒在細菌間的接合轉移過程Fig.3 The process of conjugative of resistant plasmids between bacteria

圖3(a)中，呈紅色長條狀的為抗性質粒在供體菌內成功表達的S17-1 lamp pir大腸桿菌，未熒光標記呈長條狀的為受體菌(MG1655)，圓形的為其他菌種或菌膠團。從圖3(a)～圖3(c)可以看出，在第20分鐘時，呈紅色熒光的供體菌與受體大腸桿菌和其他菌種或菌膠團接觸，第40分鐘時供體菌周圍的菌體散發出微弱的熒光，第60分鐘時更多的受體大腸桿菌和其他菌種呈紅色熒光。該過程證實，ARGs可以在同種屬或不同種屬細菌之間進行水平轉移。

2.3.2 接合時間對質粒接合轉移的影響

實驗分別設置了接合時間為4、8、16、24、48 h的工況，觀察接合質粒的接合轉移情況。準備供體菌和受體菌的混合液15份，每個接合時間點設3份，并設置供體菌和受體菌的空白對照組；放置在25 ℃恒溫生化培養箱中，在無光照的條件下進行接合實驗，在不同接合時間時，將相應的樣品涂布于攜帶雙抗性(KAN+CHI)的固體LB培養基中篩選接合子，并統計接合子濃度，實驗結果如圖4所示。

圖4 接合時間對抗性質粒接合轉移的影響Fig.4 Effect of conjugative time on conjugative transfer of resistance plasmid

由圖4可知，在4～48 h之內，質粒接合子濃度隨時間的增加而依次遞增，在第48小時時接合子濃度最大，均值為(2.150.31)104CFU/mL；在4、8、16、24 h接合子濃度分別為(3.900.33)102、(1.650.26)103、(2.951.57)103、(1.380.13)104CFU/mL，并且在第24小時時增長率達到最大為3.66%。根據細菌生長曲線可知兩種大腸桿菌混合接種到新的培養基環境時，細菌數量快速增長，增加了細菌之間的接觸頻率，并且細菌在此時的密度基本上達到最大，有利于質粒的接合轉移，增加了發生接合轉移的概率。

2.3.3 溫度對質粒接合轉移的影響

溫度會影響細菌的繁殖速率以及酶的活性，同樣溫度的變化對大腸桿菌生長速率和細菌細胞內外源基因的表達也有著非常重要的作用。實驗分別設置了低溫(4 ℃)、常溫(25 ℃)、高溫(50 ℃)3組實驗工況，進一步探究溫度對質粒pHS-AVC-LW1144上的卡那霉素基因接合轉移的影響。取供體菌和受體菌的混合液9份，每個溫度工況設3份，并設置供體菌和受體菌的空白對照，靜置16 h后，統計接合子濃度，實驗結果如圖5所示。

圖5 溫度對抗性質粒接合轉移的影響Fig.5 Effect of conjugative temperature on conjugative transfer of resistance plasmid

由圖5可知，溫度越高，接合子濃度越低。在低溫工況下(4 ℃)，質粒的接合子濃度明顯大于常溫以及高溫工況下的接合子濃度；高溫工況下的質粒轉移接合子濃度最低，僅為(1.001.41)102CFU/mL；這是由于實驗采用的大腸桿菌為耐低溫的孢子形態細菌，在低溫情況下仍然具備較強的活性[19]，并且在低溫條件下供體菌和受體菌更容易達到感受態狀態，更有助于發生質粒的接合轉移；而高溫環境下絕大部分細菌已經失活，降低了質粒中ARGs的表達。丁滿生等[20]研究溫度誘導對重組大腸桿菌質粒拷貝數的影響時，在42 ℃條件下持續誘導之后發現，高溫環境對菌體造成代謝負荷的增加以及菌體活性的下降導致質粒拷貝數整體下降。另外常溫情況下細菌生長曲線在3～4 h時達到較高的細胞密度(OD600約為0.6)，在這段時間得到的轉化率最高，但高轉化率的持續時間較短；而在低溫環境中，接種后24 h內的轉化率都會維持在較高水平，從而導致了低溫工況下的接合子濃度高于常溫和高溫工況。

2.3.4 pH對質粒接合轉移的影響

為探究pH對細菌接合轉移的影響，實驗中配置了pH分別為5、7、9的鹽酸緩沖鹽溶液，將這三種不同pH的鹽酸緩沖鹽溶液重新懸浮供體菌和受體菌混合液，每個pH工況的混合液設3份，并設置空白對照組，放置于37 ℃恒溫生化培養箱中，靜置培養16 h，統計接合子濃度，實驗結果如圖6所示。

圖6 pH對抗性質粒接合轉移的影響Fig.6 Effect of conjugative pH on conjugative transfer of resistance plasmid

由圖6可知，接合子濃度隨pH升高而增大，并且在pH=9的堿性環境中，接合子濃度最大，為(1.360.45)104CFU/mL，分別為中性和酸性環境下接合子濃度的4.6倍和13倍。這是由于大腸桿菌MG1655更適于生存在偏堿性環境中，細菌的生長代謝速率高，一定程度上促進了質粒的水平轉[21]；在酸性環境中，菌株的活性較低，導致接合子濃度較低，轉移頻率也較低，僅為(1.60±0.42)×10-5。Müller[22]研究環境和代謝酸對大腸桿菌生長行為的影響中發現， pH較高的條件對所測的188種大腸桿菌的生長率具有顯著的促進作用。張海容等[23]在研究大腸桿菌堿性磷酸酶的構象變化中，得出堿性磷酸酶的熒光強度隨pH的增大而增強，促進了人大腸桿菌的生長速率，一般認為是酸性環境破壞了穩定蛋白質三級結構的靜電作用，導致細菌活性較低。

3 結論

(1)城市污水廠二級出水中的仍然存在較高濃度的ARGs，并且相對分子質量大小主要分布在大于100 kDa范圍內；二級出水中游離態ARGs濃度高于細胞態ARGs。

(2)抗性質粒pHS-AVC-LW1144可在同種屬或跨種屬細菌間進行接合轉移；在0～48 h，抗性質粒濃度呈現遞增趨勢，在第48 h濃度達到最大；低溫工況(4 ℃)下的接合子濃度遠高于常溫(25 ℃)和高溫(50 ℃)工況，促進質粒轉移的效果顯著；堿性(pH=9)條件對抗性質粒接合轉移的促進效果優于酸性(pH=5)和中性(pH=7)條件，堿性條件更有利于抗性質粒的接合轉移。