高效價冷凝集素和蛋白樣凝集對輸血相容性檢測的影響及對策*

虞 茜，許 飛，鄒 昕，楊紅梅

江蘇省常州市中心血站，江蘇常州 213004

健康人體內的冷凝集素不會影響輸血相容性檢測，但高效價冷凝集素和(或)伴不規則抗體是引起ABO血型鑒定困難和配血困難的主要因素[1-3]，也是輸血科經常碰到的難題，尤其是某些病理原因導致的高效價冷凝集素和蛋白樣凝集往往會導致血型正反定型不一致和配血不合的現象。本研究對341例輸血相容性檢測不合的患者標本進行回顧性研究，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年11月至2019年11月常州地區各大醫院輸血相容性檢測不合送本中心血站實驗室的標本341例，其中39例血標本在處理前血型鑒定、抗體篩查和交叉配血中均出現強凝集，男23例，女16例，年齡11～85歲。39例疾病類型包括自身免疫性貧血、多發性骨髓瘤、高球蛋白血癥、骨髓異常增生綜合征(MDS)、慢性肺心病、傳染性單核細胞增多癥(簡稱傳單癥)、冷凝集素綜合征(CAS)、陣發性睡眠性血紅蛋白尿(PNH)、外傷。

1.2儀器與試劑 抗-A/B單克隆抗體、抗-D(IgM)單克隆抗體、抗-C、抗-c、抗-E、抗-e、抗體篩選細胞、國產譜細胞、抗人球蛋白試劑、抗IgG、抗C3d、2-巰基乙醇(2-Me)均來自上海血液生物醫藥有限公司。進口譜細胞、ABO血型反定型紅細胞、酸放散試劑盒、生理鹽水、凝聚胺試劑、抗球蛋白卡、KA-2200血清學專用離心機、37 ℃恒溫水浴箱、低速自動平衡離心機。

1.3方法 試管法鑒定ABO正反定型、抗人球蛋白試驗、抗體鑒定及交叉配血等所有試驗均嚴格按照文獻[2]的方法和試劑操作說明書執行。

1.4紅細胞處理 臨床上送至本實驗室的所有患者標本紅細胞均用生理鹽水洗滌3次配成2%左右紅細胞懸液，鏡檢無凝集時進行輸血相容性檢測。對于自身凝集紅細胞均采用45 ℃溫生理鹽水洗滌6次配成2%左右紅細胞懸液，鏡檢無凝集時進行輸血相容性檢測，如鏡檢仍有凝集加等量2-Me應用液置37 ℃水浴30 min，洗滌鏡檢無凝集時進行上述試驗，鏡檢有凝集時進行吸收放散試驗。

1.5血清處理 隨機選取獻血者O型紅細胞3～5份洗滌后與患者血清按照1∶1混合或者取患者紅細胞洗滌后與患者血清1∶1混合，置4 ℃吸收1 h；取患者血清按照1∶1加入2-Me置37 ℃水浴30 min，進行輸血相容性檢測。

1.6冷凝集素效價測定 采用試管法對血清倍比稀釋，血清50 μL，第2管為血清50 μL與50 μL生理鹽水混合液，將第2管中的50 μL混合液移置第3管，以此類推。效價所用細胞為試劑O細胞懸液；各管中細胞加入量為50 μL，整個體系為100 μL，分別做4 ℃ 15 min、室溫下冷凝集素效價(本實驗室以出現+的最高稀釋倍數為最終效價)。

2 結 果

2.1患者血標本處理前后血型鑒定結果對照 39例患者血標本在處理前血型鑒定、抗體篩查和交叉配血及自身對照中均出現強凝集，且患者血型正反定型不符。患者血標本處理后進行輸血相容性檢測。39例患者中，A型14例，B型11例，O型4例，AB型10例，RhD均(+)，見表1。

表1 患者血標本處理前后血型鑒定結果對照

2.2患者血標本處理前后直接抗人球蛋白試驗(DAT)結果對照(試管法) 39例患者血標本各醫院送檢單顯示正反不符及DAT陽性，申請特殊配血。本實驗室根據患者疾病分類，發現多發性骨髓瘤、高球蛋白血癥、MDS、CAS和PNH患者紅細胞均自凝，DAT用AB漿做陰性對照，如AB漿呈陽性，說明DAT結果不可靠。經處理后的紅細胞做抗體篩查試驗，發現341例患者中39例抗體篩查試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及自身凝集強度基本一致，其中9例多發性骨髓瘤凝集鏡下檢查為緡錢狀凝集，經鹽水置換凝集消失，非真凝集，判定為蛋白樣凝集。對于其他30例抗體篩查試驗陽性標本進行溫度試驗及抗體特異性鑒定。對懷疑為抗I抗體的血清標本與成人O型(含I抗原)和臍血O型(含i抗原)紅細胞在室溫、4 ℃進行抗體檢測。見表2。

表2 患者疾病分類及血標本處理前后DAT結果分布

2.3抗體特異性鑒定 39例患者血標本處理前輸血相容性試驗在鹽水介質、凝聚胺介質、抗人球卡中均呈凝集，上譜細胞進行抗體特異性鑒定。30例中，10例由高效價冷凝集素引起，7例由冷凝集伴同種抗體引起，13例由冷凝集素伴自身抗體引起。

2.4冷凝集素效價測定 30例患者中，25例患者冷凝集素效價為128～512，但5例高球蛋白血癥患者冷凝集素效價達到1 024，最高甚至高達2 048；均不同程度地影響了輸血相容性檢測結果。

3 討 論

在臨床工作中既要對交叉配血不合的情況進行分析和判斷，又要對抗體篩查及抗體特異性鑒定的試驗結果進行具體分析。當抗體篩查試驗陽性且抗體特異性鑒定血清與譜細胞反應強度基本一致，而自身對照陰性時，應考慮抗體可能有以下3種情況：(1)專與O細胞的抗體，如抗-I、抗-HI、抗-IH或抗-H；(2)高頻抗原的抗體，這些抗體一般都是高效價、低親和力抗體，可通過測定效價，觀察凝集強度和效價的關系；(3)針對譜細胞的抗體，因為譜細胞所用的保養液中EDTA、氫化可的松、乳糖等均可能吸附于譜細胞，如果患者體內有相關的一些藥物，可能會造成特異性譜細胞凝集，但這些凝集可在試驗前用生理鹽水洗滌紅細胞加以解決。當抗體篩查試驗陽性且抗體特異性鑒定血清與譜細胞反應強度基本一致，而自身對照陽性時，應考慮可能有以下5種情況：(1)存在自身抗體，這種情況下譜細胞與血清反應強度一致，同時自身細胞上放散出同樣的抗體，這種情況少見，因為一般自身抗體會全部吸附到自身紅細胞上；(2)同種抗體與自身抗體同時存在，同種抗體和自身抗體可以同時存在，但同種抗體存在時一般譜細胞會出現反應強弱不一的格局，可借以判斷同種抗體可能存在的特異性；(3)可能是類抗體所致，類抗體常出現于DAT陽性紅細胞放散液中，類抗體的存在與患者相應抗原陰性、陽性無關。(4)冷凝集，一般冷凝集素在室溫(25 ℃)下即失去活力，但有些冷凝集素在30 ℃時還能凝集紅細胞，更有極高效價冷凝集素引起的紅細胞凝集在37 ℃孵育中仍不散開，這時可在37 ℃和4 ℃分別做抗體效價，以確定冷凝集素的存在。可用自身或兔紅細胞反復吸收放散除去血清中的冷凝集素，或者45 ℃溫生理鹽水反復洗滌紅細胞除去冷抗體，也可以用2-Me處理血清或紅細胞，排除IgM性質冷凝集素的干擾；(5)假凝集，某些高分子物質、血清蛋白異常、低離子強度或者酸性環境等均可造成紅細胞假凝集。當抗體篩查試驗陰性且與譜細胞不良反應而自身對照陽性時，應考慮可能有以下4種情況：(1)自身抗體，存在自身抗體的患者，血清中常沒有可檢出的自身抗體，幾乎所有抗體均吸附到自身細胞上，造成自身細胞DAT陽性；(2)多凝集紅細胞，患者紅細胞可能是多凝集性紅細胞；(3)補體C3陽性，患者紅細胞可能在體內或者體外被補體C3致敏，這種致敏常由IgM性質的冷抗體造成，因此在血清中沒有可檢出的抗體；(4)輸血反應，患者的抗體可能完全被吸附到輸入的紅細胞上，造成血清中沒有可檢出的抗體，所以自身細胞表現出DAT陽性，而DAT真陽性應為輸入的紅細胞。

對39例患者標本進行分析發現，有9例多發性骨髓瘤患者的標本出現緡錢狀凝集。正常情況下，紅細胞表面唾液酸帶負電荷形成Zate電位，導致紅細胞表面同性電荷相互排斥，從而保持較好的穩定性。當患者體內呈高球蛋白血癥狀態時，患者可出現蛋白紊亂、球蛋白增加，清蛋白/球蛋白倒置，使紅細胞表面Zate電位改變，導致紅細胞呈緡錢狀假凝集。9例多發性骨髓瘤患者由于骨髓里有大量漿細胞增殖導致血清中出現異常的免疫球蛋白，導致血清蛋白比例改變，從而影響紅細胞表面電位導致紅細胞發生緡錢狀凝集，造成血型鑒定或者交叉配血不合等輸血相容性檢測困難[4]。緡錢狀凝集的標本特征比較明顯，在血型鑒定和抗體篩查時不該凝集的試管中出現弱凝集，且凝集強度類似，鏡檢可見緡錢狀凝集，生理鹽水置換血漿后鏡檢緡錢狀凝集消失呈陰性。由于緡錢狀凝集不是由特異性抗體導致，通常不會導致輸血不良反應。在交叉配血時采取經典抗人球蛋白法，可以有效消除緡錢狀凝集的影響[5]。

其余30例是由于冷凝集素引起的。健康人一般體內都有冷凝集素，但效價一般不超過16，而且在室溫或者32 ℃無活性。理論上講，凡是37 ℃與自身紅細胞不反應，而在低于37 ℃環境下才能和自身紅細胞反應的抗體可稱為冷自身抗體，實際上冷自身抗體在4 ℃才與自身細胞反應。因此，盡管大多數人血清中存在冷自身抗體，但在體內溫度下并不會與自身細胞發生反應，也不會造成任何不良影響，但在一些惡性腫瘤、心肺疾病、傳單癥等情況下，患者體內出現高效價冷凝集素，有些甚至室溫下有活性，具備結合補體能力引起自身免疫性溶血性貧血或CAS，會嚴重干擾血型鑒定、DAT、抗體篩查試驗、抗體鑒定試驗及交叉配血。甚至高效價冷自身抗體常常在較低的體外條件下將補體成分致敏在紅細胞上，造成DAT、間接抗人球蛋白試驗陽性，而這些陽性并不代表患者體內的情況。在交叉配血過程中若發現存在高效價冷凝集素，應做冷凝集素確認試驗，包括溫度、效價、補體結合能力3個部分；有條件的實驗室應進一步檢測冷凝集素特異性，甚至要區分該冷凝集素是抗-I、抗-HI、抗-IH還是抗-H等情況。有文獻報道，高效價抗-I患者反復輸血可產生同種抗體，這大大增加了抗體特異性鑒定的難度，同時，當效價≥512或者室溫效價≥32時均有可能引起嚴重輸血反應[6-8]。在輸血相容性檢測中引起交叉配血不合的原因很多，如不規則抗體、自身免疫性疾病產生的自身抗體、蛋白紊亂及藥物因素等；針對不同因素采用不同方法處理紅細胞和血清以解決交叉配血不合的問題[9-10]；解決疑難配血的關鍵是對交叉配血不合原因作出正確判斷，根據試驗結果結合相關原因作出正確判斷，選擇相合血液，保障臨床安全有效地輸血。