構建腫瘤免疫治療PD-L1靶向PET分子探針68Ga-NOTA-WL12及生物學觀察

蔣金泉，李 丹，劉特立，夏 雷，徐曉霞，郭曉軼，朱 華*，楊 志

(1.德陽市人民醫院放射科，四川 德陽 618000；2.北京大學腫瘤醫院暨北京市腫瘤防治研究所核醫學科，惡性腫瘤發病機制及轉化研究教育部重點實驗室，北京 100142)

抗程序性細胞死亡受體1(programmed death 1, PD-1)及其配體(programmed death ligand 1, PD-L1)信號通路的免疫阻斷治療可明顯提高部分黑色素瘤、非小細胞肺癌、腎癌等多種實體腫瘤的客觀緩解率[1-9]。腫瘤細胞表面PD-L1表達量與患者能否從抗PD-1/PD-L1信號通路治療中獲益存在一定相關性[10-12]，故準確評估腫瘤患者體內PD-L1表達具有重要意義。目前臨床主要通過免疫組織化學[13]方法檢測腫瘤患者PD-L1表達情況并篩選適應證，但受限于PD-L1在腫瘤組織內表達的異質性及動態變化性[14-15]等因素，僅約30%經此法篩選出的PD-L1表達陽性腫瘤患者獲益[16]。本研究以雙功能螯合劑NOTA(2-[4,7-bis-(carboxymethyl)-[1,4,7]triazonan-1-yl]acetic acid)對WL12進行耦聯，以68Ga標記，獲得分子探針68Ga-NOTA-WL12，觀察生物分布，評價其檢測腫瘤PD-L1能力。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 NOTA-WL12(上海強耀生物科技有限公司)，醋酸鈉、三氟乙酸(中國國藥集團有限公司)，乙腈(Merck)，生理鹽水(北京原子高科股份有限公司)，濃鹽酸、乙醇、正辛醇(北京化學試劑有限公司)，異氟烷(河北一品制藥股份有限公司)，質量分數20%人血清白蛋白(HSA，成都蓉生藥業有限責任公司)，均為分析純。

1.2 主要儀器 鍺鎵發生器(Isotope Technologies Garching)，Hypersil BDS C-18反向色譜柱5 μm，250.0 mm×4.6 mm(YMC)，C-18柱(Waters公司)，放射性薄層色譜掃描儀(默克Radio-TLC)，高效液相色譜儀(安捷倫)，放射性測量活度計(Capintec)，多探頭全自動伽瑪計數儀(Wiz-ard2)，MatrxVIP 3000小動物麻醉系統(Mismark)，小動物PET/CT(平生醫療科技有限公司)。

1.3 實驗動物 正常雌性昆明鼠、非肥胖型糖尿病/嚴重聯合免疫缺陷鼠(NOD/SCID)及BALB/c裸鼠均購自北京維通利華生物科技股份有限公司，6～8周齡,體質量18～20 g。遵照北京腫瘤醫院實驗動物操作規范完成實驗，倫理批準號：2019KT62。中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、人乳腺癌細胞(MDA-MB-231)均來自美國模式培養物集存庫(ATCC)。穩定高表達人PD-L1的中國倉鼠卵巢細胞(CHO-hPD-L1)及小鼠模型來源于本實驗室。

1.468Ga-NOTA-WL12制備及純化 將4 ml 0.05 mol/L HCl緩慢推注至鍺鎵發生器，量取 3 000 μl68Ga淋洗液至EP管中，以1.0 mol/L NaAc將pH調至4.5，隨后加入10 μl濃度為2 mg/ml的NOTA-WL12于上述EP管中，將反應體系置于孵育器60℃條件下反應15 min。待體系溫度降至室溫后，以2 ml注射器取出反應體系，加至已活化的C-18柱，用3 ml超純水淋洗柱子，最后用0.7 ml 80%乙醇淋洗C-18柱，獲得純化后的標記產物68Ga-NOTA-WL12。

1.568Ga-NOTA-WL12質控 將反應后產物及純化后產物各2 μl滴至TLC-SG試紙(寬度為1)下端1 cm處，并將試紙置于展開體系[1 ml生理鹽水加20 μl飽和乙二胺四乙酸(EDTA)]中，待體系展開至距下端10 cm處時將其取出并晾干，行Radio-TLC掃描分析，并計算保留值。

采用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)，Hypersil BDS C-18反向色譜柱(5 μm，250.0 mm×4.6 mm)，溫度25℃，以體積分數0.1%的三氟乙酸水溶液為A相，體積分數0.1%的三氟乙酸乙腈溶液為B相，針對梯度流動相進行分析，使10～15 min B相由5%增加至80%、流速1.0 ml/min，觀察放射性峰保留時間。

1.6 體外穩定性實驗 取3.7 MBq68Ga-NOTA-WL12分子探針溶液，分別加至1 ml生理鹽水和5% HSA溶液中，置于37℃條件下孵育，分別于10、30、60、120及240 min 后取200 μl標記產物，行Radio-HPLC分析。

1.7 脂水分布 取50 ml 0.01 mol/L磷酸緩沖鹽溶液和50 ml正辛醇，混合均勻后靜置24 h；以5個2.5 ml EP管分別取1.0 ml飽和后上層正辛醇和0.9 ml下層磷酸緩沖鹽溶液，再加入0.1 ml含0.74 MBq68Ga-NOTA-WL12 的0.01 mol/L磷酸緩沖鹽溶液，振蕩混勻后3 000 r/min離心5 min，最后分別取100 μl上層正辛醇和下層磷酸緩沖鹽溶液進行計數，以logP±SD表示脂水分布值。

1.8 生物分布 將15只體質量18～20 g雌性昆明小鼠隨機分為5組，經尾靜脈注射1.85 MBq68Ga-NOTA-WL12，分別于注射后15、30、60、120、240 min處死，解剖獲得小鼠血、肺、心臟、肝臟、腎臟、脾臟、肌肉、股骨及腦組織，分別稱重并進行γ計數。以注射劑量的1%為標準樣本，同時計數，通過Excel和Prism8.0軟件計算各臟器每克組織百分注射劑量率(%ID/g)。

1.9 小動物PET/CT顯像 對PD-L1表達陽性的CHO-hPD-L1小鼠模型及陰性對照組人乳腺癌MDA-MB-231小鼠動物模型各3只(瘤體直徑約1.0 cm)行PET/CT顯像。經尾靜脈注射約7.4 MBq68Ga-NOTA-WL12,分別于30、60、120 min進行PET顯像，顯像時間為15 min。行阻斷實驗以驗證所得分子探針檢測腫瘤PD-L1的特異性，對CHO-hPD-L1小鼠經尾靜脈同時注射7.4 MBq68Ga-NOTA-WL12和50 μg未標記的WL12，分別于60、120 min進行顯像，觀察分子探針在腫瘤病灶內的攝取情況，測定并比較各時間點腫瘤病灶及肌肉標準攝取值(standardized uptake value, SUV)。

2 結果

2.168Ga-NOTA-WL12標記率及放射化學純度 整個標記及純化過程可于30 min內完成。對純化前反應體系行Radio-TLC分析，得到68Ga對NOTA-WL12放射標記率為(98.68±0.06)%(n=3)；對純化后產物68Ga-NOTA-WL12分別行Radio-TLC和Radio-HPLC分析，結果顯示純化后標記化合物68Ga-NOTA-WL12放射化學純度>99%，見圖1。68Ga-NOTA-WL12終產物為無色透明溶液,pH 4.0～4.5。Radio-HPLC分析顯示目標化合物68Ga-NOTA-WL12的保留時間為10.38 min。

圖1 68Ga-NOTA-WL12 Radio-TLC及Radio-HPLC分析 A.純化前產物的Radio-TLC結果； B.純化后產物的Radio-TLC結果； C.純化后產物的Radio-HPLC結果

2.268Ga-NOTA-WL12的體外穩定性 標記物68Ga-NOTA-WL12穩定性良好，在生理鹽水體系中放置240 min，放射化學純度仍高達99%；5% HSA體系中放置240 min 后放射化學純為97%，見圖2。脂水分布值為-0.191±0.046，表明該分子具有相對良好的水溶性。

圖2 68Ga-NOTA-WL12體外穩定性分析結果 圖3 68Ga-NOTA-WL12在正常昆明小鼠體內生物分布情況

2.368Ga-NOTA-WL12體內分布 經尾靜脈對正常昆明小鼠注射1.85 MBq68Ga-NOTA-WL12后不同時間點各臟器生物分布見圖3，肝腎攝取水平較高。

2.4 PET/CT顯像68Ga-NOTA-WL12主要分布于肝臟、腎臟及膀胱，且在PD-L1表達陽性腫瘤病灶中濃聚；阻斷實驗小鼠腫瘤病灶對分子探針攝取明顯降低，對照小鼠各時間點內腫瘤病灶內未見明顯分子探針攝取，腫瘤病灶與肌肉SUV比值均小于1.5。

3 討論

多項研究[17-20]表明，以放射性核素標記對PD-1/PD-L1信號通路有特異靶向性的單克隆抗體、納米、多肽分子作為分子探針并進行PET顯像，有望實時、動態、準確評估腫瘤患者體內PD-L1表達及變化情況，并用以篩選可自治療中獲益的腫瘤患者。WL12是對PD-L1具有特異靶向性的環狀多肽[21]。本研究制備分子探針68Ga-NOTA-WL12，并觀察其生物學特性。

本研究利用雙功能螯合劑NOTA對PD-L1特異靶向的環狀多肽分子進行耦聯和68Ga標記，成功獲得了分子探針68Ga-NOTA-WL12。通過NOTA分子耦聯，在60℃、pH 4.5條件下，68Ga對NOTA-WL12可于15 min內獲得98%標記率；體外穩定性實驗結果顯示該分子探針4 h內在生理鹽水及HSA中均有良好穩定性，為進一步體內動物實驗提供了基礎；脂水分布值為-0.191±0.046，表明該分子具有相對良好的水溶性，這可能是生物分布和小動物PET顯像中肝臟較高攝取的原因。注射后4 h內該分子探針在小鼠體內各臟器中呈現逐漸上升、之后降低趨勢，2 h后主要分布于肝、腎及腸道中，與小動物PET顯像結果基本相符。肝臟高攝取可能與該分子探針的脂溶性及代謝相關，腎臟高攝取可能與其代謝相關。2 h內腫瘤內分子探針逐漸濃聚，通過共注射方式可明顯阻斷腫瘤病灶攝取分子探針，而肝腎等攝取未見明顯降低；該分子探針在PD-L1表達陰性腫瘤病灶中未見明顯攝取，證實其可用于特異性檢測腫瘤病灶內PD-L1表達。

本研究所制備的68Ga-NOTA-WL12為標記率高、穩定性良好且對腫瘤內PD-L1具有特異靶向性的分子探針，但在肝腎內的非特異性濃聚較高，需要進一步改進。

圖4 小動物PET/CT顯像 A.CHO-hPD-L1小鼠模型各時間點PET/CT顯像及其阻斷實驗顯像； B.CHO-hPD-L1小鼠模型各時間點腫瘤病灶與肌肉SUV比值(*：P<0.001)； C.陰性對照MDA-MB-231小鼠模型各時間點PET/CT顯像； D.陰性對照組MDA-MB-231小鼠模型各時間點腫瘤病灶與肌肉SUV比值