脂肪干細(xì)胞移植治療大鼠視神經(jīng)損傷的應(yīng)用價(jià)值

唐平 李雷 陳執(zhí) 呂博琦 趙楠楠 李蒙恩

視神經(jīng)損傷是嚴(yán)重致盲性眼病，由于視神經(jīng)位于眼球后部，眼眶外傷、腦外傷均可視神經(jīng)管骨折，進(jìn)而壓迫視神經(jīng)形成損傷[1]。外傷為第一次損傷，外傷形成的壓迫可再次導(dǎo)致二次損傷，進(jìn)一步損害殘存視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGCs)的血供，進(jìn)而導(dǎo)致RGCs死亡，可導(dǎo)致機(jī)體視力永久喪失[2,3]。為此當(dāng)前視神經(jīng)損傷的治療要求是保存殘余RGCs，減少視神經(jīng)的二次損傷，促進(jìn)視神經(jīng)軸突再生，從而促進(jìn)改善患者的視力[4]。當(dāng)前該病并無(wú)有效治療方法，多采用上調(diào)神經(jīng)生長(zhǎng)因子、促神經(jīng)生長(zhǎng)等方法，但是治療效果一直不太顯著[5]。現(xiàn)代研究表明炎癥在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起到關(guān)鍵作用，當(dāng)神經(jīng)受到損傷時(shí)，會(huì)立即激活炎性反應(yīng)，釋放自由基、細(xì)胞因子、補(bǔ)體、前列腺素類(lèi)等炎性介質(zhì)，導(dǎo)致神經(jīng)損傷[6,7]。模式識(shí)別受體toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)與固有性免疫激活有關(guān)，可參與調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷中的免疫應(yīng)答[8]。有研究發(fā)現(xiàn)在周?chē)窠?jīng)損傷中，在缺乏TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路中，延遲了軸突再生和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的修復(fù)，也延遲了巨噬細(xì)胞的募集[9,10]，不過(guò)在視神經(jīng)損傷中的作用還無(wú)相關(guān)報(bào)道。干細(xì)胞是一類(lèi)有自我復(fù)制能力的多潛能細(xì)胞，包括臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞等，可以替代受損的神經(jīng)元、促進(jìn)神經(jīng)元的存活和軸突再生[11]。隨著再生醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)已成為熱點(diǎn)，脂肪組織被認(rèn)為是多潛能干細(xì)胞可供選擇的來(lái)源，ADSCs不僅能分化為脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等，也可表達(dá)與其相似的蛋白[12,13]。并且許多機(jī)體擁有過(guò)剩的脂肪，應(yīng)用無(wú)創(chuàng)和無(wú)痛的方法可獲得大量的ADSCs，在治療中的應(yīng)用比較方便[14]，本研究通過(guò)建立視神經(jīng)鉗夾損傷動(dòng)物模型，明確模型大鼠RGCs的變化規(guī)律，通過(guò)向模型大鼠視神經(jīng)損傷部位鞘內(nèi)注射ADSCs，以明確ADSCs對(duì)視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用與作用機(jī)制，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 成年SD級(jí)健康雄性大鼠(40只)由海南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供(動(dòng)物合格證號(hào)：瓊2039211)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)條件及實(shí)驗(yàn)操作流程均遵守動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心相關(guān)規(guī)定，體重220～250 g。隨機(jī)將其分為4組，分別為對(duì)照組、模型組、干細(xì)胞組、凍存液組，每組8只。

1.2 視神經(jīng)損傷模型的制作 選擇3 g/100 ml濃度的水合氯醛腹腔麻醉模型組、ADSCs組、凍存液組的大鼠，在大鼠右眼上瞼靠后9∶00～12∶00位作垂直切口，向剪開(kāi)穹窿部結(jié)膜，游離眼球后部脂肪，暴露并剪斷上直肌、視神經(jīng)，動(dòng)脈瘤夾于球后2 mm夾持視神經(jīng)5～10 s，觀察大鼠瞳孔情況。模型制作成功標(biāo)準(zhǔn)：傷后10 min 瞳孔散大，間接對(duì)光反射存在，直接對(duì)光反射消失，且眼底明確未損傷大鼠眼動(dòng)脈、眼底供血情況供恢復(fù)良好。模型制作完畢后縫合球結(jié)膜，抗菌藥物滴眼液抗感染。

1.3 脂肪干細(xì)胞的獲取 取另外5只SD大鼠，取其脂肪組織，用于分離脂肪干細(xì)胞。收獲第三代細(xì)胞，取1×104的樣本進(jìn)行流式細(xì)胞表型鑒定，采用的抗體包括CD11b、CD19、CD34、CD45、CD73、CD90、CD105、等。

1.4 治療方法 模型制作成功后，模型組不做任何處理，干細(xì)胞組立即于損傷部位視神經(jīng)鞘內(nèi)注射ADSCs，干細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/ml，注射體積為10 μl；凍存液組立即于損傷部位視神經(jīng)鞘內(nèi)注射凍存液，注射體積為10 μl。

1.5 觀察指標(biāo) 所有大鼠分別于傷后7、28 d處死4只大鼠，心臟去血液標(biāo)本后，取眼球和視神經(jīng)標(biāo)本，使用多聚甲醛心臟灌注，對(duì)照組正常眼球作為對(duì)照組同時(shí)取材。(1)視神經(jīng)和眼球標(biāo)本的采集：取大鼠頭部，分離眼球及周?chē)浗M織，經(jīng)顱內(nèi)上丘剪斷視神經(jīng)貼近眼球球根部剪斷視神經(jīng)，顱內(nèi)取出視神經(jīng)。視神經(jīng)使用4%的多聚甲醛保存，眼球于眼球固定液內(nèi)保存。(2)HE染色：組織樣本固定于4%多聚甲醛24 h后，連續(xù)切片，厚度為4 μm，采用HE染色步驟如下，中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。(3)免疫組織分析：固定的組織樣本用65℃烘箱中烘片2 h，脫蠟至水，微波修復(fù)，PBS洗滌3次，放入3%過(guò)氧化氫溶液，PBS洗滌3次，去除BSA液，加入50 μl稀釋的一抗，PBS洗滌3次，加入二抗，PBS洗滌3次，DAPI避光染核5 min，PBS洗滌3次后用抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡觀察。(4)RGCs計(jì)數(shù)：光學(xué)顯微鏡(400倍)下觀察視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)變化并拍照，每個(gè)標(biāo)本計(jì)數(shù)3張片子，每個(gè)切片隨機(jī)取5個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞核作為視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞數(shù)量，同時(shí)進(jìn)行免疫熒光染色RGCs計(jì)數(shù)。(5)炎性因子檢測(cè)：取組織樣本提取總蛋白，采用Western blot檢測(cè)白介素-6(IL-6)(1∶1 000)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)(1∶1 000)蛋白在視神經(jīng)上的表達(dá)變化。

2 結(jié)果

2.1 脂肪干細(xì)胞細(xì)胞表型 第3～6代ADSCs呈現(xiàn)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)紡錘形，48 h能夠擴(kuò)增2倍數(shù)量，具有連續(xù)傳代并保持其形態(tài)的特性。考慮細(xì)胞活力與數(shù)量，本實(shí)驗(yàn)采用第6代細(xì)胞。流失細(xì)胞儀檢測(cè)顯示第6代細(xì)胞ADSCs不表達(dá)CD11b、CD19、CD34、CD45，高表達(dá) CD73、CD90、CD105 間充質(zhì)源性分子標(biāo)記，能夠很好的保持其表型特征。見(jiàn)圖1。

圖1 脂肪干細(xì)胞細(xì)胞表型

2.2 視神經(jīng)HE染色病理變化結(jié)果 正常視神經(jīng)，顯微鏡下可見(jiàn)鞘膜完整，細(xì)胞排列整齊，層次分明。視神經(jīng)損傷后7 d，HE染色顯示損傷部位出現(xiàn)空泡化，視神經(jīng)鞘膜完整，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。損傷后28 d可見(jiàn)視神經(jīng)萎縮變細(xì)和膠質(zhì)瘢痕增生，表明模型建立成功。見(jiàn)圖2。

對(duì)照組 模型組7d 模型組28d

2.3 視網(wǎng)膜HE染色與免疫熒光分析 模型建立7 d，模型組、干細(xì)胞組與凍存液組之間RGCs數(shù)量對(duì)比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；模型建立28 d，干細(xì)胞組RGCs多于模型組和凍存液組，對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3、4,表1、2。

圖3 視網(wǎng)膜HE染色(×400)

圖4 視網(wǎng)膜免疫熒光染色(×400)

表1 4組視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)(HE染色) n=4,個(gè),

表2 4組視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)(免疫熒光) n=4,個(gè),

2.4 4組炎性因子表達(dá)比較 Western blot檢測(cè)顯示IL-6、TNF-α在模型組中損傷后都呈現(xiàn)高表達(dá)狀況，干細(xì)胞組的表達(dá)水平低于模型組與凍存液組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 不同組別的炎性因子相對(duì)表達(dá)水平比較

3 討論

視神經(jīng)損傷當(dāng)前比較常見(jiàn)，多是外傷導(dǎo)致嚴(yán)重的視力功能障礙，在臨床上主要表現(xiàn)為視力下降、色覺(jué)障礙、眼底改變、相對(duì)性傳入性瞳孔阻滯。視神經(jīng)損傷分為直接損傷和間接損傷，直接損傷可導(dǎo)致視神經(jīng)管骨折，一般預(yù)后比較差[15]。間接性損傷主要損傷部位為管內(nèi)段視神經(jīng)，其發(fā)病涉及視神經(jīng)血腫、受壓、水腫以及腦脊液循環(huán)改變等[16]。現(xiàn)代研究表明，視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷后不可再生，視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞死亡后視力將永久喪失[17]。本實(shí)驗(yàn)采用SD大鼠視神經(jīng)鉗夾損傷動(dòng)物模型，模型成功率較高，其病理生理改變可完全模擬臨床視神經(jīng)損傷病理生理變化。

大鼠的視網(wǎng)膜構(gòu)成分為視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層、外核層、外叢狀層等，視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜層次開(kāi)始紊亂、RGCs出現(xiàn)死亡，但是有部分RGCs能夠幸存并且長(zhǎng)期存活，也為臨床治療提供了基礎(chǔ)[18]。視神經(jīng)損傷的治療包括保守治療和手術(shù)治療，但是各種治療手段都有一定的缺陷。大劑量激素有嚴(yán)重副作用，手術(shù)治療對(duì)于機(jī)體的創(chuàng)傷比較大。視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞位于視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞層，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的組成部分。在一定條件下，干細(xì)胞可以分化成多種功能類(lèi)型細(xì)胞，特別是間充質(zhì)干細(xì)胞沒(méi)有致瘤性，在體外有免疫抑制性，也使得同種異體移植，缺乏免疫排斥反應(yīng)[19,20]。有研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有神經(jīng)保護(hù)作用，能促進(jìn)視神經(jīng)纖維再生[21]。ADSCs可穩(wěn)定增殖，具有取材方便、干細(xì)胞含量高、創(chuàng)傷小等優(yōu)點(diǎn)。有研究表明靜脈注射ADSCs可有效減輕小鼠體重、降低膽固醇、增加高密度脂蛋白、降低血糖、增加糖耐量，并且降低肝臟中脂肪堆積，增胰島素受體的表達(dá)[22,23]。ADSCs具有強(qiáng)大的體外擴(kuò)增能力，體外建立神經(jīng)誘導(dǎo)環(huán)境后可定向分化為具有神經(jīng)細(xì)胞的生物學(xué)特性的細(xì)胞，可為神經(jīng)系統(tǒng)損傷提供種子細(xì)胞。目前為止還沒(méi)有完全特異性的細(xì)胞表型來(lái)鑒別MSCs，只能利用多種細(xì)胞表面標(biāo)記來(lái)鑒別ADSCs。本研究顯示第6代細(xì)胞ADSCs不表達(dá)CD11b、CD19、CD34、CD45，高表達(dá) CD73、CD90、CD105間充質(zhì)源性分子標(biāo)記，能夠很好的保持其表型特征，這是從脂肪中分離間充質(zhì)干細(xì)胞的特異性標(biāo)記之一。本研究顯示模型建立7 d，模型組、干細(xì)胞組與凍存液組之間RGCs數(shù)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；模型建立28 d，干細(xì)胞組RGCs多于模型組和凍存液組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。相關(guān)研究也表明在急性肺損傷模型中，向小鼠氣管內(nèi)注射ADSCs可減輕減少肺內(nèi)細(xì)菌數(shù)量，減輕金黃色葡萄球菌肺炎、降低小鼠死亡率[24,25]。有研究表明ADSCs可以減輕氧自由基和炎性因子對(duì)脊髓的進(jìn)一步損傷，減少細(xì)胞凋亡和突變，并且無(wú)明顯不良反應(yīng)，顯著提高再生坐骨神經(jīng)的連續(xù)性和神經(jīng)功能[26,27]。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷伴隨的炎癥應(yīng)答在神經(jīng)學(xué)上具有雙重作用，即促進(jìn)神經(jīng)元再生或者引起神經(jīng)元繼發(fā)性損害[28,29]。損傷后，正常情況下視神經(jīng)是不能再生的，眼內(nèi)炎癥可引起RGCs轉(zhuǎn)變成活躍的生長(zhǎng)狀態(tài)。特別是當(dāng)視神經(jīng)損傷后，正常情況下表現(xiàn)出很少的再生能力[30]。盡管目前炎性介質(zhì)在神經(jīng)損傷后的再生作用存在一定的爭(zhēng)議，炎性反應(yīng)在神經(jīng)再生方面的作用受到廣泛重視。有研究顯示在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，TLR4主要在星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，當(dāng)小膠質(zhì)細(xì)胞激活后，TLR4可大量表達(dá)[31]。特別是在神經(jīng)炎性反應(yīng)中，TLR4產(chǎn)生應(yīng)答，引起腦損傷。有研究也顯示中樞神經(jīng)系統(tǒng)死亡可通過(guò)激活TLR4信號(hào)通道，緊壞死的神經(jīng)元激活小膠質(zhì)細(xì)胞里MyD88，導(dǎo)致IL-6、TNF-α的釋放[32]。另外TLR4可能在控制神經(jīng)性疼痛、軸突再生和組織修復(fù)過(guò)程中也發(fā)揮重要作用，脊髓損傷時(shí)TLR2和TLR4的激活調(diào)節(jié)損傷后的炎性反應(yīng)及神經(jīng)膠質(zhì)增生[33,34]。本研究顯示W(wǎng)estern blot檢測(cè)顯示IL-6、TNF-ɑ在模型組中損傷后都呈現(xiàn)高表達(dá)狀況，干細(xì)胞組的表達(dá)水平低于模型組與凍存液組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示TLR4介導(dǎo)的炎性反應(yīng)在視神經(jīng)損傷后的早期繼發(fā)性損害過(guò)程中發(fā)揮一定作用，也可能是視神經(jīng)損傷后介導(dǎo)炎性反應(yīng)的一條重要通道。ADSCs能夠抑制抗炎效應(yīng)，從而發(fā)揮視網(wǎng)膜保護(hù)作用、促進(jìn)神經(jīng)再生作用[35,36]。不過(guò)本研究也存在一定的缺陷，ADSCs的具體作用機(jī)制還不太明確，對(duì)TLR4信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響闡述還不夠深入，將在下一步的研究中進(jìn)行深入分析。

綜上分析，ADSCs治療大鼠視神經(jīng)損傷可減緩視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的下降速度，抑制TLR4信號(hào)通路中炎性因子的表達(dá)，對(duì)視神經(jīng)損傷具有保護(hù)作用。