生物炭對酚酸脅迫下番茄生長和土壤微生態的影響

涂玉婷，黃繼川，彭智平，吳雪娜，廖偉杰

（廣東省農業科學院農業資源與環境研究所/廣東省養分資源循環利用與耕地保育重點實驗室/農業農村部南方植物營養與肥料重點實驗室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】化感自毒效應是植物通過地上部及其凋落物的揮發、淋溶以及根系分泌和植株殘茬腐解等途徑，釋放出的次生代謝物，對自身或種內其它植物生長產生危害的一種現象［1］。已有研究表明，高等植物分泌的化感物質主要是酚酸類和萜類，以及少數含氮化合物、聚乙炔和香豆素等次生物質。其中酚酸類化感物質因其活性強，相對總量高，被研究者們作為化感自毒物質的重點研究對象［2-3］。高濃度的酚酸類化感物質通過影響植物細胞膜透性、水分和養分吸收、光合速率、抗氧化酶活性等途徑對植物的生長代謝過程和生長調節系統產生抑制作用；自毒物質對根際微生物具有趨化作用，使有益微生物減少，病原微生物增加［4-5］。近年來快速發展的設施蔬菜栽培技術存在種植結構單一、復種指數高的特點，這種連作模式下，土壤中酚酸類物質的累積導致的自毒作用和土壤微生態失衡，已被證實是造成連作障礙的根本原因［6］。開發去除連作土壤中化感自毒物質的技術，并明確其作用機制，是從根源上解決連作障礙的有效措施。

【前人研究進展】為了緩解日益嚴重的連作障礙問題，實際生產中采用客土法、土壤熏蒸、施用微生物制劑、施用土壤改良劑等，其中施用生物炭已經被認為是一種成本較低、效果穩定的方法之一［7］。生物炭是以生物質為原料，在高溫缺氧條件下熱解產生的一類具有微孔結構豐富、比表面積大、穩定性強等一系列優異性質的多功能材料。武春成等［8］研究發現按連作土壤質量比5%施入玉米秸稈生物炭，可使土壤pH提高0.56個單位，速效鉀含量提高8.6%，有效降低土壤真菌和尖孢鐮刀菌數量，提高細菌數量，細菌/真菌比值是對照的14.3倍，通過對黃瓜根區土壤微生態環境的改善，促進了黃瓜生長和產量的提高。已有研究表明，生物炭的施用能有效降低土壤中殘余酚酸含量，并一定程度地緩解連作條件下化感物質對番茄、黃瓜、蘋果、烤煙等作物的化感脅迫效應［9-12］，還具有改善連作土壤理化性質、提高土壤酶活性、優化微生物群落結構的作用［13-15］。

【本研究切入點】目前已有的研究大多關注外源生物炭對化感脅迫下“植株-土壤-微生物”體系中某一個或幾個元素的變化情況，缺乏對體系中各元素之間變化的關聯性分析。番茄是世界上也是我國栽培面積最大的茄果類蔬菜之一，在連作條件下番茄根系分泌的酚酸類化感自毒物質極易在土壤中累積，從而引發較為嚴重的連作障礙問題。本研究以番茄為供試作物，通過盆栽試驗，考察施用生物質炭對酚酸脅迫下番茄植株生長和生理指標、果實產量和品質、土壤理化性質及酚酸含量的影響，利用高通量測序技術研究番茄根際土壤中細菌和真菌群落結構對酚酸類化感物質和生物炭輸入的響應情況，通過相關性分析和冗余分析揭示“生物炭-土壤環境因子-根際土壤微生物-植株”之間的關聯性與相互作用機制。研究結果將為設施蔬菜產業的可持續發展提供理論依據和實踐指導。【擬解決的關鍵問題】探索酚酸脅迫下“植株-土壤-微生物”體系中各因子對外源生物炭輸入的響應特征及各因子之間變化的關聯互作機制，對深入解析生物炭連作土壤生態調控效應，開發穩定高效的生物炭基連作土壤調理劑具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試番茄品種千禧圣女果為廣東地區栽培的主要小番茄品種之一。苯甲酸、香草酸、對羥基苯甲酸、阿魏酸、肉桂酸均購買自阿拉丁試劑（上海）有限公司。生物炭由花生殼在700 ℃下隔絕空氣熱解2 h制備，花生殼生物炭的產率為24.1%，灰分含量為1.4%，比表面積為83.4 m2/g，pHPZC為8.33，陽離子交換量為7.42 cmol/kg。供試土壤為赤紅壤，前茬為水稻。土壤pH 6.21，EC值0.24 μs/cm，有機質2.15%，堿解氮93.54 mg/kg，速效磷81.82 mg/kg，速效鉀59.8 mg/kg，全氮1.01 g/kg，全磷1.10 g/kg，全鉀12.25 g/kg。

1.2 試驗方法

試驗于2019年10月至2020年4月在廣東省農業科學院農業資源與環境研究所溫網室（113°20′54.63″E，23°08′47.56″N）進行。試驗用直徑26.0 cm、高24.0 cm的塑料盆，每盆裝入已去除石礫和動植物殘體的風干土壤6.5 kg。試驗設3個處理：CK，風干土壤+1.3 L無菌水（含水率20%）；T1處理，風干土壤+1.3 L混合酚酸溶液；T2處理，風干土壤+5%生物炭+1.3 L混合酚酸溶液。試驗參照張玥琦等［16］和李亮亮等［17］研究確定的番茄根系和根際土壤中酚酸的種類和濃度進行混合酚酸溶液的配制，施用后，使土壤中酚酸類物質的初始濃度為苯甲酸50 μg/g、香草酸40 μg/g、對羥基苯甲酸25 μg/g、阿魏酸10 μg/g、肉桂酸10 μg/g，總酚酸含量為135 μg/g。挑選長至六葉一心且長勢基本一致的番茄幼苗進行盆栽，每缽1株，每個處理3次重復，每個重復30株，此后每3 d澆1次水，以澆透而不滲出為度。采用單桿整枝，主枝長至2 m時打頂，每穗留6個果實。試驗期間各處理采用一致的施肥管理。

1.3 測定項目及方法

移栽后30 d和120 d，用百分之一電子天平分別對各處理番茄植株的生物量、地上部和地下部鮮重進行測定，采用TTC法（氯化三苯基四氮唑法）測定番茄根系活力。于2020年2月3日開始采收番茄果實，每次采收時各株單獨計產，各次采摘的產量相加即為單株總產量，用萬分之一電子天平稱量并計算各處理平均單果重。統一選取各處理第2穗和第3穗小番茄進行果實品質測定，其中維生素C含量測定采用2,6-二氯腚酚測定法，可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定，有機酸含量采用酸堿滴定法測定。盛果期時每個處理選取5顆番茄采用抖土法收集各處理根際土壤，并均勻混合，一部分于-80 ℃超低溫冰箱保存用于土壤殘余酚酸含量和土壤微生物多樣性的測定，另一部分風干后過1 mm篩用于土壤常規理化指標測定。

土壤pH值采用水土比2.5∶1 pH計法測定；土壤電導率采用電導率儀法測定；土壤有機質采用重鉻酸鉀外加熱法測定；堿解氮用堿解擴散硼酸吸收法；速效磷采用鉬銻抗比色法測定；速效鉀采用NH4OAc浸提-火焰光度法測定；土壤全氮采用全自動凱氏定氮儀測定；全磷采用NaOH熔融-鉬銻抗比色法測定；全鉀采用NaOH熔融-火焰光度法測定。

土壤中殘余酚酸的提取參考李培棟等［18］的方法。使用1 mol/L NaOH，按土水比1∶1對土壤中的酚酸進行浸提24 h，并通過超聲波處理30 min以提高提取效率，離心分離后用12 mol/L鹽酸將溶液pH調整至2.5以沉淀胡敏酸。靜置2 h后8 000 r/min離心10 min，上清液過0.22 μm濾膜后于4 ℃保存。濾液中總酚酸的測定采用福林酚比色法［19］，濾液中苯甲酸、香草酸、對羥基苯甲酸、阿魏酸、肉桂酸的濃度采用Waters e2695 Alliance高效液相色譜檢測，色譜柱為Water Symmetry C18（5.0 μm,4.6 mm×250 mm），進樣量為20 μL，柱溫30 ℃，檢測波長280 nm，流動相為0.1%甲酸溶液/甲醇（70∶30,V/V），流速0.8 mL/min，采用峰面積外標法進行定量分析。

土壤細菌和真菌的微生物多樣性測定由北京百邁客生物科技有限公司完成。采用德國Macherey-Nagel公司的NucleoSpin 96 Soi土壤DNA 提取試劑盒提取土壤總DNA，按照試劑盒說明書進行操作，采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取DNA的純度和濃度，檢測合格后對土壤DNA進行PCR擴增和高通量測序。土壤細菌16S rRNA（V3+V4）區的上游擴增引物為338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）；下游引物為806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。真菌ITS1區上下游擴增引物分別為ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2（5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'）。在Illumina HiSeq平臺上完成測序后，使用百邁客云平臺進行細菌/真菌豐富度和多樣性分析、菌群的分類學組成分析。

試驗數據采用Microsoft Excel 2007 和SPSS 19.0 軟件進行處理和統計分析，使用鄧肯氏新復極差法進行差異顯著性測驗，使用Origin 9.0作圖。

2 結果與分析

2.1 不同處理對番茄植株生長和生理指標的影響

由圖1可知，施用外源酚酸的T1處理與CK相比，移栽后30 d、120 d番茄植株生物量分別減少23.6%和10.0%，地下部鮮重分別減少37.2%和24.0%，根冠比分別降低12.6%和18.8%，根系活力分別下降39.2%和48.5%，說明試驗所添加的外源酚酸對番茄植株的根系活力、地下部和地上部的生長均表現出顯著抑制作用；施用生物炭的T2處理移栽后30 d、120 d番茄植株生物量比T1處理分別增加11.3%和8.0%，地下部鮮重增加27.0%和18.2%，根冠比分別提高15.2%和6.3%，根系活力分別增加30.6%和25.2%。與CK相比，移栽后30 d番茄苗各生長和生理指標的相對增幅均高于收獲期。可見，施加適量的生物炭，有利于緩解酚酸對番茄幼苗根部和地上部的抑制效應，提高根系活力，改善植株形態特征，且這種調控作用在番茄苗期的改善效果要優于收獲期。

2.2 不同處理對番茄果實產量和品質的影響

由表1可知，與CK相比，施用外源酚酸后番茄單株產量和單果重分別降低9.5%和11.9%，且差異顯著。與T1處理相比，施用生物炭（T2處理）可顯著提高酚酸脅迫下番茄單株產量和單果重，增幅分別為15.2%和4.3%。番茄品質方面，外源酚酸的添加導致番茄維生素C和可溶性糖含量分別降低18.2%和11.0%，有機酸含量增加26.2%，糖酸比降低29.9%。而添加生物炭能使酚酸脅迫下番茄果實的維生素C、可溶性糖和糖酸比分別增加17.6%、6.6%和32.0%，有效提高番茄果實品質，改善果實風味。

2.3 不同處理對土壤理化性質的影響

由表2可知，與對照相比，施用外源酚酸處理的土壤pH值降低，有機質、堿解氮、有效鉀、全氮、全鉀含量均發生下降現象，降幅為2.1%～18.3%；土壤EC值、有效磷和全磷含量出現不同程度升高。施用生物炭可顯著提高土壤pH值，降低EC值，并緩解外源酚酸對土壤養分指標的影響。與T1處理相比，T2處理土壤有機質、堿解氮、有效鉀、全氮、全鉀含量分別提高64.2%、6.1%、8.6%、13.8%和5.8%。

表1 不同處理對番茄產量和品質的影響Table 1 Effect of different treatments on tomato yield and quality

表2 不同處理對土壤理化性質的影響Table 2 Effects of different treatments on soil physical and chemical properties

由表3可知，T1處理土壤中殘余的苯甲酸、香草酸、對羥基苯甲酸、阿魏酸、肉桂酸和總酚酸含量均顯著高于CK。而與T1處理相比，T2處理可使土壤中5種殘余酚酸含量降低14.6%～36.6%，總酚酸含量降低25.3%，表明生物炭能一定程度地降低土壤中殘余酚酸含量。但是施用外源酚酸的T1處理土壤殘余總酚酸含量僅比CK增加1.2 μg/g，占初始添加總酚酸用量的0.9%，說明施入土壤中的酚酸會經過土壤吸附、微生物分解等作用導致游離酚酸含量的降低。

2.4 不同處理對根際土壤微生物多樣性的影響

由表4可知，T1處理反映土壤樣本細菌群落豐富度的ACE指數和Chao1指數分別比CK降低4.7%和5.5%，且差異顯著；辛普森指數和香農指數則可同時反映物種豐富度和均勻度，T1處理辛普森指數低于CK，香農指數比CK高5.9%。

表3 不同處理對土壤殘余酚酸含量的影響Table 3 Effects of different treatments on the contents of residual phenolic acids in soil（ng/g）

表4 不同處理土壤樣品細菌多樣性指數Table 4 Diversity indexes of bacteria in soil samples under different treatments

由表5可知，與CK相比，T1處理反映土壤真菌豐富度的ACE指數和Chao1指數平均值分別增加34.1和32.4%，辛普森指數下降0.2%，香農指數增加6.7%，表明施用外源酚酸可導致番茄根際土壤細菌群落豐富度顯著降低，真菌群落豐富度顯著提升，而土壤中細菌和真菌群落的均勻度都得到一定程度的增加。與T1處理相比，施用生物炭（T2處理）可有效提升酚酸脅迫下土壤樣品細菌群落ACE指數、Chao1指數和香農指數，分別提高18.0%、18.4%和10.7%；真菌多樣性指數則呈現相反的變化趨勢，T2處理的土壤樣品真菌群落ACE指數、Chao1指數和香農指數比T1處理分別降低10.3%、9.6%和5.5%，且差異顯著。由此可見，施用生物炭可顯著增加酚酸脅迫下番茄根際土壤的細菌群落多樣性，降低真菌群落多樣性。

2.5 番茄產量、品質與土壤環境因子及微生物的相關性分析

對番茄單株產量和反應品質的糖酸比與土壤理化性質進行相關性分析，結果（表6）表明，番茄產量與土壤pH、總氮的質量分數呈極顯著正相關，與堿解氮和有效鉀質量分數呈顯著正相關，與殘余總酚酸呈極顯著負相關，與土壤有效磷質量分數呈顯著負相關；糖酸比與有效鉀、總氮質量分數呈極顯著正相關，與pH也存在顯著正相關關系，與有效磷、總磷、殘余總酚酸質量分數呈顯著負相關。

表5 不同處理土壤樣品真菌多樣性指數Table 5 Diversity index es of fungus in soil samples under different treatments

表6 番茄產量和品質與土壤理化性質的相關性分析Table 6 Correlation analysis of tomato yield and quality with soil physical and chemical properties

進一步選取與產量和品質有顯著相關性的土壤環境因子，包括pH、堿解氮、有效磷、速效鉀、總氮、總磷、總酚酸含量，采用冗余分析（Redundancy analysis,RDA）解析3個處理根際土壤細菌和真菌主要群落、土壤環境因子、番茄產量與品質之間的相關關系，結果（圖2）顯示3個處理的細菌群落結構組成具有顯著差異，RDA分析的軸1和軸2解釋了土壤細菌綱水平上群落變異程度的74.0%。向量擬合結果顯示番茄產量和品質與γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、δ-變形菌綱（Deltaproteobacteria）、放線菌綱（Actinobacteria）的豐度呈正相關，與酸桿菌綱（Acidobacteriia）的豐度呈負相關。其中γ-變形菌綱、δ-變形菌綱的豐度與總氮、pH、堿解氮呈正相關，放線菌綱豐度與速效鉀呈正相關。施用生物炭的T2處理與這3個土壤環境因子也呈正相關，說明施用外源生物炭可通過提高土壤pH、總氮、堿解氮含量，進而促進與番茄產量和品質呈正相關的變形菌豐度的增加。此外，施用生物炭處理還與芽孢桿菌綱（Gemmatimonadetes）豐度呈顯著正相關。從圖2還可以看出，施用外源酚酸處理與土壤殘余酚酸呈正相關，而TPhA與酸桿菌綱（Acidobacteriia）豐度呈正相關，表明施用外源酚酸會導致土壤總酚酸含量升高，從而促進與番茄產量和品質呈負相關的細菌群落豐度增加。

3個處理根際土壤真菌群落結構與土壤環境因子和番茄產量、糖酸比的冗余分析結果（圖3）顯示，前2個排序軸公共解釋了不同處理真菌綱水平上群落結構變異的51.2%，屬水平上群落豐度與番茄產量和品質呈正相關的真菌有傘菌屬（Agaricomycetes）、小壺菌綱（Spizellomycetes），呈負相關的有座囊菌綱（Dothideomycetes）、糞殼 菌綱（Sordariomycetes）、被 孢霉 綱（Mortierellomycetes）。T1處理與座囊菌綱（Dothideomycetes）、糞殼菌綱（Sordariomycetes）、被孢霉綱（Mortierellomycetes）的豐度呈正相關，T2處理則與傘菌綱（Agaricomycetes）、小壺菌綱（Spizellomycetes）豐度呈正相關。可見，外源酚酸的添加會導致與番茄產量和品質呈負相關的細菌和真菌群落豐度的增加，而添加生物炭有利于促進與番茄產量和品質呈正相關的細菌和真菌群落豐度的提高。

3 討論

本試驗所用酚酸濃度下，番茄根系活力出現顯著下降，植株生物量、單株產量、單果重、可溶性糖、維生素C含量均出現明顯下降，表明酚酸脅迫下番茄植株生長受到抑制，果實品質變劣。這一結果與已有的研究報道相似。翟彩霞等［20］研究發現每公斤土壤添加100～200 μg/mL苯甲酸或香豆素對番茄苗期的生長具有顯著的抑制作用，具體表現為株高降低0.35～2.02 cm，復葉數、復葉長和葉面積減少；張恩平等［21］的研究表明，苯甲酸和肉桂酸的施用均會導致番茄幼苗根部丙二醛含量的增加，并打破番茄根部保護酶系統原有的平衡，造成根系的膜質過氧化。這主要是由于酚酸類化感物質可引發植物體內活性氧自由基的大量生成，同時，酚酸類化感物質對植株體內的抗氧化酶活性具有抑制作用，阻礙自由基的清除，過多的自由基易攻擊細胞膜結構中的多不飽和脂肪酸，造成細胞膜結構氧化損傷，細胞膜透性升高，根系活力降低，嚴重影響根系對營養物質的吸收，從而導致植株生長受限、果實品質下降［2,5］。施用生物炭可顯著緩解酚酸對番茄生長的抑制作用。本研究中添加5%生物炭可有效促進番茄根系發育，提高植株生物量和果實產量，果實的可溶性糖、維生素C含量和糖酸比得到提高，與酚酸脅迫處理相比，添加生物炭可有效改善番茄品質。金巖等［9］、吳玨等［22］的研究也發現添加生物炭對番茄具有促生、增產、提質的效果，與本研究結果一致。

為了探究生物炭對酚酸脅迫下番茄生長的促進和果實品質提升的作用機制，本研究進一步測定了3個處理中土壤理化性質和番茄根際土壤微生物群落結構變化情況。結果表明，外源酚酸的添加導致土壤EC值和磷含量增加，pH、有機質、氮和鉀含量均出現不同程度的下降。這與陳龍池等［23］的研究結果相似。由于酚酸類物質可以與土壤中的Al、Fe、Mn、P結合形成復合物，導致可溶性鹽類含量增加，EC值升高，同時增加土壤中磷的供給。此外，高濃度酚酸還會抑制與土壤碳循環相關的多酚氧化酶和蔗糖酶的活性，降低與氮素轉化相關的脲酶和蛋白酶活性，從而導致土壤有機質含量下降，供氮能力減弱［24-25］。

添加生物炭的處理，可有效緩解酚酸對土壤理化性質的影響，表現為土壤pH、有機質、氮和鉀含量顯著提高。已有研究表明，由于生物炭具有較強的堿性，施入土壤后可顯著提高土壤pH值。此外，生物炭具有豐富的孔隙結構，對土壤水分、鹽分、養分吸附能力強，可有效降低土壤EC值，保持土壤肥力［26］。番茄收獲期土壤殘余酚酸的測定結果表明，添加生物炭可有效降低土壤中殘余酚酸的含量，這種去除作用一方面源于生物炭對酚酸的吸附［27］，另一方面可能源于生物炭輸入導致土壤微生物群落結構發生變化，從而加速酚酸的生物降解。

本研究對根際土壤微生物α多樣性分析結果表明，外源酚酸的施入總體上降低土壤細菌多樣性，提高真菌多樣性。已有研究表明，酚酸類化感物質能夠選擇性地抑制根際土壤中氨化細菌、硝化細菌、根際促生細菌，酸化的土壤環境對真菌的生長具有促進作用［28-29］。添加生物炭可促進酚酸脅迫下細菌微生物多樣性的增加，并降低真菌多樣性。這主要是由于施入生物炭引起土壤酸堿度、電導率、水分等理化指標發生改變，升高的pH值有利于抑制真菌的繁殖，碳氮比的優化則有利于促進細菌豐度的增加。本研究的相關性分析結果表明提高土壤pH、堿解氮、有效磷和總氮含量，降低有效磷、總磷和土壤總酚酸含量，均有利于番茄產量和品質的提升。冗余分析結果表明，以上土壤理化性質的改變有利于促進變形菌、放線菌、芽孢桿菌、小壺菌豐度的增加，研究已證實這些菌中具有較多根際促生菌和病原菌拮抗菌。酸桿菌常作為土壤惡化的生物學指標［30］，冗余分析表明酸桿菌豐度與番茄產量和品質呈負相關。施用外源酚酸處理會促進酸桿菌豐度增加，而添加生物炭與酸桿菌豐度呈負相關，即具有抑制作用。

4 結論

本研究采用盆栽試驗，并結合土壤理化性質測定方法和基于16S rRNA/ITS1基因的Illumina HiSeq 高通量測序技術，研究施用生物炭對酚酸脅迫下番茄生長和生理特性、土壤理化性質、根際土壤微生物群落結構的影響。結果表明，與外源酚酸脅迫處理相比，添加生物炭可顯著提高番茄植株提高根系活力，增加生物量和單株果實產量，并改善果實品質。5%生物炭的添加量可顯著提高酚酸脅迫下土壤的pH值，降低EC值和總酚酸含量，土壤有機質、堿解氮、有效鉀、全氮、全鉀均有不同程度提高。相關性分析表明，土壤pH、堿解氮、速效鉀、總氮含量與番茄果實產量或品質存在顯著或極顯著的正相關性，而有效磷、總磷、總酚酸含量與番茄果實產量或品質存在顯著或極顯著的負相關性。冗余分析結果表明，與番茄果實產量和糖酸比呈正相關的變形菌鋼（Proteobacteria）、放線菌鋼（Actinobacteria）、傘菌鋼（Agaricomycetes）、小壺菌鋼（Spizellomycetes）的豐度與土壤總氮、pH、堿解氮、速效鉀也存在一定程度的正相關。與番茄果實產量和糖酸比呈負相關的酸桿菌鋼（Acidobacteriia）、座囊菌鋼（Dothideomycetes）、糞殼 菌鋼（Sordariomycetes）、被 孢霉 鋼（Mortierellomycetes）的豐度與土壤總酚酸含量呈正相關。說明生物炭施入導致土壤pH、堿解氮、速效鉀等理化性質的提高和總酚酸含量的降低，土壤環境因子的改變能夠驅動與番茄果實產量和品質呈正相關的微生物種群豐度的增加，并對番茄果實產量和品質呈負相關的微生物種群起到抑制作用。生物炭通過對土壤理化因子和微生物群落結構的雙重調控作用，從而緩解酚酸類化感物質對番茄植株生長的抑制，實現果實產量和品質的提升。