HPLC法測定飼料中7種青霉素類藥物含量

丁晨紅，黃曉梅，王威利，萬 凱，蘇秋權，李亞菲

（廣東省農業科學院農產品公共監測中心/農業農村部農產品質量安全風險評估實驗室（廣州），廣東 廣州 510640）

【研究意義】青霉素類藥物屬于β-內酰胺類抗生素，是獸醫臨床最常用的抗生素，被廣泛應用于畜牧養殖業［1］。根據《飼料藥物添加劑使用使用規范》及其補充說明，飼料中不得添加青霉素類藥物。由于抗生素藥渣中含有豐富的蛋白質和微量抗生素成分，在飼料和飼養過程中使用對動物有一定的促生長作用。2002年農業部176號公告明確禁止在飼料和動物飲用水中使用抗生素濾渣。我國農業農村部公告第194號規定，自2020年7月1日起，飼料生產企業停止生產含有促生長類藥物飼料添加劑（中藥類除外）的商品飼料。而近年來，在養殖飼料中違規添加使用阿莫西林等青霉素類藥物以及青霉素藥渣的情況屢見不鮮。青霉素及青霉素藥渣的濫用會在動物體內產生藥物殘留，導致細菌產生耐藥性，對養殖業造成嚴重危害，也會嚴重危害人體健康、破壞環境［2-4］。許多國家和地區對青霉素類藥物在動物源性食品中的殘留進行了嚴格限制，我國農業部公告第235號中規定動物肌肉中阿莫西林、氨芐西林、青霉素 G、氯唑西林、苯唑西林的最高殘留限量分別為50、50、50、300、300 μg/kg；歐盟指令No.2377/90/EEC規定動物肌肉中阿莫西林、氨芐西林、青霉素 G、苯唑西林、氯唑西林、雙氯西林、萘夫西林的最高殘留限量分別為50、50、50、300、300、300、300 μg/kg。我國已制定動物源食品中青霉素類藥物殘留量的多個檢測標準，研究飼料中青霉素類藥物殘留量檢測方法對從飼料源頭控制青霉素類藥物的濫用和亂用具有重要現實意義。

【前人研究進展】目前對青霉素類藥物殘留的檢測方法已有較多報道，包括免疫分析法［5-6］、毛細管電泳法［7-8］、微生物測定法［9］、高效液相色譜法［10-16］、液相色譜-串聯質譜法［17-20］、電化學法［21］等；其中高效液相色譜法和液相色譜-串聯質譜法具有操作簡單、分離快、效率高等特點，是青霉素類藥物殘留檢測的主流分析方法；而液相色譜-串聯質譜法對儀器設備要求高，普通實驗室的配置難以達到要求。相較而言，液相色譜法具有更好的實際應用前景。

【本研究切入點】青霉素類藥物檢測方法研究大多集中于動物體及蛋、奶中的殘留，對于飼料樣品中青霉素類藥物含量檢測的相關研究很少。飼料樣品種類繁多、成分復雜、基質干擾強，高效液相色譜法測定青霉素類藥物的應用受到一定制約，同時測定飼料中7種青霉素類藥物含量的方法更鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】本試驗擬通過柱前衍生增強樣品中青霉素類藥物的紫外吸收，提高檢測靈敏度，從而建立飼料中7種青霉素類藥物的高效液相色譜檢測方法，為飼料中青霉素類藥物的測定提供支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

主要試劑：乙腈、甲醇（色譜純，Merk公司）；氫氧化鈉、檸檬酸鈉、磷酸氫二鈉、乙二胺四乙酸二鈉、苯甲酸酐、氯化汞、1,2,4-三氮唑、五水硫代硫酸鈉、二水磷酸二氫鈉、無水磷酸氫二鈉、四丁基硫酸氫銨（分析純，廣州化學試劑廠）；青霉素類藥物標準品：阿莫西林、青霉素G、青霉素V、氨芐西林、苯唑西林、氯唑西林、雙氯西林（純度≥90.0%，德國Dr.Ehrenstrofer GmbH公司）；親水親脂平衡型（HLB）固相萃取柱（200 mg/6 mL，Waters）；0.22 μm微孔尼龍濾膜（津騰）。供試的配合飼料、濃縮料、精料補充料以及添加劑預混料為市售。

主要儀器：LC-30A高效液相色譜儀（日本島津公司）、恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）、調速振蕩器（上海比朗儀器制造有限公司）、5804R臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）、渦旋儀（美國Labnet公司）。

1.2 溶液配制

1.2.1標準儲備溶液（1 000 μg/mL）配置稱取適量青霉素類藥物標準對照品（精確至0.01 mg），置于10 mL棕色容量瓶中，用50%乙腈溶液溶解并定容至刻度，搖勻，于-20℃儲藏，有效期1個月。

1.2.2混合標準系列工作溶液（100 μg/mL）配置 準確量取阿莫西林、青霉素G、青霉素V、氨芐西林、苯唑西林、氯唑西林、雙氯西林標準儲備液（1.2.1）各1 mL，置于同一10 mL容量瓶中，用50%乙腈溶液稀釋至刻度，-20℃儲藏，有效期1個月。

1.2.3EDTA-Mcllvaine緩沖溶液 分別稱取檸檬酸鈉0.96 g、磷酸氫二鈉70.0 g、乙二胺四乙酸二鈉37.2 g，加水溶解，定容至1 000 mL，用5 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH至8.0，混勻，臨用現配。

1.2.4衍生化溶液配置 稱取1,2,4-三氮唑13.78 g于100 mL棕色瓶中，用60 mL水溶解，加入10 mL現配制的0.1 mol/L氯化汞溶液，用5 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH至9.0（±0.5），用水稀釋至100 mL，溶液為渾濁狀態。4℃避光保存，有效期3個月。

1.2.5磷酸鹽緩沖溶液配置 取五水硫代硫酸鈉2.00 g，用水溶解，再加入二水磷酸二氫鈉5.00 g、無水磷酸氫二鈉2.50 g和四丁基硫酸氫銨3.25 g，用適量水溶解稀釋到1 000 mL，過0.22 μm微孔尼龍濾膜。

1.3 樣品前處理

1.3.1配合飼料、濃縮飼料、精料補充料 稱取試樣2 g于50 mL離心管中，加入20 mL 20%乙腈溶液，漩渦混合30 s，振蕩20 min。10 000 r/min離心5 min，取500 μL上清液待衍生化。

1.3.2添加劑預混合飼料 稱取試樣2 g于50 mL離心管中，加入20 mL EDTA-Mcllvaine緩沖液，漩渦混合30 s，超聲10 min，10 000 r/min離心5 min，取上清液待凈化。HLB固相萃取小柱依次用甲醇、水各5 mL活化，取5.0 mL樣液過柱，先用3 mL水淋洗，抽干，加入5.0 mL乙腈洗脫，收集洗脫液，渦旋混勻后取500 μL待衍生化。

1.3.3衍生化 向所得待衍生化試液中加入50 μL 0.01 mol/L苯甲酸酐溶液，渦旋混勻后50℃水浴反應5 min，冰浴快速冷卻至室溫后加入450 μL衍生化溶液，再次渦旋混勻后65℃水浴反應10 min，冰浴快速冷卻至室溫；4℃下10 000 r/min離心3 min，取上層清液過微孔濾膜，6 h內上機測定。

1.4 基質匹配標準工作溶液的制備

取空白試樣，按1.3.1或1.3.2處理得到空白基質溶液。在空白基質溶液中加入適量混合標準工作溶液（1.2.2），配制成濃度為0.50、0.75、1.00、2.00、5.00、10.00、20.00 μg/mL的基質匹配標準系列溶液。取該標準系列溶液各500 μL，按1.3.3步驟進行衍生化處理，所得基質匹配標準工作液衍生物，所得最終濃度分別為0.25、0.375、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 μg/mL，供上機測定。

1.5 色譜條件

色譜柱：Agilent Symmetry Shield C18（250 mm×4.6 mm，i.d 5μm）；柱溫：30℃；檢測波長：325 nm；進樣量：50 μL；流動相：A：磷酸鹽緩沖溶液，B：乙腈；梯度洗脫：0～0.5 min 35%B，0.5～1.0 min B由35%升至40%，1.0～6.0 min B由40%升至50%，6.0～10 min B由50%升至60%并保持到12 min，12～13 mim B由60%降至35%并保持至16 min結束。

2 結果與分析

2.1 前處理方法優化

本試驗對配合飼料、濃縮飼料、精料補充料和添加劑預混合飼料采取兩種方法進行前處理。對于配合飼料、濃縮飼料和精料補充料，分別選擇水、20%乙腈、50%乙腈、80%乙腈以及純乙腈作為提取劑，對添加濃度10 mg/kg的樣品進行回收試驗。結果表明，20%乙腈水溶液作為提取劑時，目標化合物的回收率高、雜質干擾少。對于添加劑預混合飼料，以EDTA-Mcllvaine緩沖溶液作為提取劑，通過HLB固相萃取小柱凈化后，再進行衍生化反應。試驗比較了震蕩提取10、20、30 min和超聲波提取10 min的提取效果差異，表明超聲震蕩提取10 min為最優提取方式，青霉素類藥物的回收率范圍在78.5%～103.3%之間。

2.2 標準溶液及其衍生物的穩定性

取7種青霉素混合標準溶液（10 μg/mL）于-20℃保存，考察阿莫西林、青霉素G、青霉素V、氨芐西林、苯唑西林、氯唑西林、雙氯西林的穩定性，于第0、7、15、30天連續監測目標化合物濃度的變化，結果表明，目標化合物在-20℃條件下，1個月內穩定。將衍生后的7種青霉素類藥物混合溶液（濃度為1.25 μg/mL）分別置于室溫、4℃、-20℃保存，放置不同時間后，測定濃度變化，結果表明，7種青霉素類衍生物在室溫下至少可保存6 h，在4℃至少可保存48 h，在-20℃至少可保存6 d。

2.3 方法專屬性考察

以β-內酰胺類抗生素（頭孢曲松和羧芐西林）和喹諾酮類抗生素（氧氟沙星、達氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星）作為青霉素類藥物檢測的干擾物質，考察方法的專屬性。7種青霉素類藥物以及干擾物質經衍生化后的標準溶液色譜圖見圖1，以上兩類干擾物質均能與目標化合物有效分離。取空白飼料樣品，加入7種青霉素類藥物標準溶液（添加濃度為1.25 μg/mL）以及兩類干擾物質（添加濃度為2.5 μg/mL）進行加標回收試驗，結果表明，青霉素類藥物目標峰附近無干擾峰出現，目標化合物加標回收率無明顯區別，能達到檢測要求，該方法專屬性較好。

2.4 線性范圍、檢出限與定量下限

按照1.3制備基質匹配標準工作液衍生物，對于配合飼料、濃縮飼料和精料補充料使其濃度為0.25、0.375、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 μg/mL，對于添加劑預混料使其濃度為0.1、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00、10.00 μg/mL。在優化試驗條件下，以青霉素類藥物衍生物的峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線，結果表明：配合飼料、濃縮飼料和精料補充料中7種青霉素類藥物在0.25～10 μg/mL范圍內，添加劑預混合飼料中7種青霉素類藥物在0.10～10 μg/mL范圍內具有良好的線性關系，相關系數（r2）均在0.99以上。在空白飼料中添加青霉素類藥物標準品，按優化方法進行檢測，以信噪比S/N≥3計算方法的檢出限（LOD）；以S/N≥10計算方法的定量限（LOQ）。結果測得7種青霉素類藥物在配合飼料、濃縮飼料、精料補充料中的檢出限為2.5 mg/kg，定量限為5.0 mg/kg；在添加劑預混合飼料中的LOD為1.0 mg/kg，LOD為2.0 mg/kg。7種青霉素類藥物在4種飼料中定量添加濃度水平的信噪比見表1。

2.5 添加回收和精密度實驗

分別選取空白配合飼料、濃縮料、精料補充料添加5、10、25 mg/kg 3個不同濃度，空白添加劑預混料添加2、5、10、25 mg/kg 4個不同濃度進行添加回收試驗，各濃度5個平行樣品進行三批次測定，結果表明，7種青霉素類藥物批內平均添加回收率在69.6%～103.9%，3批次總平均添加回收率在70.6%～98.4%范圍，批內及批間RSD均＜15%。4種飼料中7種青霉素類藥物3批次總平均添加回收率和批間RSD值見表2。青霉素類藥物標準溶液（0.5 μg/mL）、空白配合飼料、空白添加劑預混合飼料、空白精料補充料、空白濃縮料及其添加青霉素類藥物標準品（添加劑預混料添加濃度為2 mg/kg，其他飼料添加濃度為5 mg/kg）的液相色譜圖見圖2。

表1 7種青霉素類藥物在4種飼料中定量限添加濃度水平的信噪比Table 1 S/N of seven penicillins in four feeds at the level of limit of quantitation additive concentration

表2 4種飼料中7種青霉素類藥物的總平均添加回收率和批間變異系數Table2 Total average recovery rates and coefficient of variation among batches of seven penicillins in four feeds

2.6 實際樣品測定

隨機抽取40批配合飼料、濃縮飼料、精料補充料和添加劑預混合飼料，用上述確立的方法進行測定，阿莫西林、青霉素G、青霉素V、氨芐西林、苯唑西林、氯唑西林和雙氯西林均未檢出。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

本研究選擇將青霉素類藥物通過衍生化生成特異性的青霉酸硫醇汞鹽，在325 nm波長下進行檢測。由于多數青霉素類化合物無專一的紫外吸收團，其最大吸收值一般都在200～235 nm之間，而樣品基質在此紫外吸收區域存在很高的背景干擾，另外青霉素類藥物的穩定性也很差［22］。參考農業部781號公告-11-2006《牛奶中青霉素類藥物殘留量的測定 高效液相色譜法》及其他相關文獻［10-16］，先采用苯甲酸酐溶液將阿莫西林和氨芐西林的氨基發生酰基化反應，再利用青霉素類藥物的β-內酰胺在1,2,4-三氮唑作用下發生開環反應并與三氮唑結合，最后與氯化汞作用生成特異性的青霉酸硫醇汞鹽，其最大紫外吸收波長為325 nm。通過衍生化反應大大減少了基質對目標峰的干擾，從而提高了檢測方法的靈敏度和專屬性。

3.2 樣品提取劑的選擇

對于配合飼料、濃縮飼料和精料補充料，采用20%乙腈水溶液作為提取劑時，目標化合物的回收率高，雜質干擾小。而對于添加劑預混合飼料，在用20%乙腈水溶液提取時，目標化合物阿莫西林和氨芐西林的回收率近乎為零，其他5種藥物回收率也無法滿足要求，推測添加劑預混合飼料中的重金屬、吸附劑等物質會影響青霉素類藥物的提取率以及穩定性。采用EDTA-Mcllvaine緩沖溶液（pH=8.0）作為提取液時各藥物回收率有顯著提高。這可能與EDTA與添加劑預混合飼料中的金屬離子形成絡合物，從而改善提取與凈化效果有關。然而，當提取液直接進行衍生化時，目標化合物的回收率仍為零，推測青霉素類藥物在水相中衍生化過程發生了降解；當添加一定比例的乙腈，預期達到穩定目標化合物的目的時，由于提取液中鹽含量較高，乙腈與水相發生了分層現象。因此，我們通過HLB固相萃取小柱將提取液切換成乙腈溶液，提高目標化合物在衍生化過程中的穩定性，從而達到檢測要求。

4 結論

本研究建立了飼料中阿莫西林、氨芐西林、青霉素G、青霉素V、苯唑西林、氯唑西林、雙氯西林7種青霉素藥物含量的柱前衍生高效液相色譜方法。配合飼料、濃縮飼料、精料補充料的檢測限為2.5 mg/kg，定量限為5 mg/kg；添加劑預混合飼料的檢測限為1.0 mg/kg，定量限為2.0 mg/kg；7種青霉素類藥物線性關系良好，平均加標回收率在69.6%～103.9%范圍。該方法快速、準確、專屬性及重現性好，適合日常飼料樣品中7種青霉素類藥物含量的測定。