β-catenin、NF-κB、c-myc 在尖銳濕疣皮損組織及角質形成細胞中的表達變化及意義

李真真，周真，羅卓迪，王智琴

廣東省婦幼保健院，廣州511400

尖銳濕疣是一種性傳播疾病，由HPV 感染引起，其在年輕成人中的患病率為0.5%～1%，且復發率高。HPV 多在人體溫暖潮濕的條件下繁殖，因此尖銳濕疣臨床表現為男性包皮、龜頭及女性陰部或肛門附近出現淡紅色柔軟的丘疹，數目逐漸增多，且體積逐漸增大，表面凸凹不平［1］。HPV 分為 100 多個亞型，臨床可見的尖銳濕疣90%以上由HPV6 或HPV11 引起。角質形成細胞受損可引起多種皮膚疾病，過度增殖的角質形成細胞可發展為鱗癌或基底細胞癌［2］。β 連環素（β-catenin）是環連蛋白家族中的一員，參與多種細胞的增殖和分化［3］。核因子κB（NF-κB）參與多種基因的轉錄調控，在多種腫瘤中表達異常［4］。c-myc 是原癌基因，參與調控細胞的生長，在多種腫瘤中表達異常［5］。但有關NF-κB、c-myc 在尖銳濕疣皮損及角質形成細胞中的表達變化研究較少。本研究對尖銳濕疣皮損組織及角質形成細胞中NF-κB、β-catenin、c-myc 的表達變化進行觀察，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇 2018 年 1 月—2020 年 5 月本院皮膚科收治的尖銳濕疣患者70例，均符合尖銳濕疣的診斷標準，其中初診37 例、復發33 例。根據感染的HPV 分為HPV16/18 型32 例（高危型組）、感染HPV6/11型38例（低危型組）。高危型組男13例、女19 例，年齡 24～64（31.54 ± 4.93）歲，病程 1～15 年，皮損位于包皮（男）、宮頸（女）；低危型組男15例、女22 例，年齡22～65（32.50 ± 5.62）歲，病程1 個月～11年，皮損位于包皮（男）、宮頸（女）。另選志愿者30例作為正常對照組，為本院包皮環切或子宮肌瘤手術患者，均排除HPV 感染、無局部皮膚病或系統性疾病。其中男 10 例、女 20 例，年齡 26～64（33.70 ±6.15）歲。三組性別、年齡比較差異無統計學意義（P均>0.05）。各組均簽署知情同意書，本研究經醫院醫學倫理委員會審核批準。

1.2 組織中 NF-κB、β-catenin、c-myc 蛋白表達檢測 采用免疫組化法。取尖銳濕疣患者皮損組織及正常對照組正常包皮、宮頸組織，石蠟包埋，制備切片。取石蠟切片，經脫蠟、水化，用pH7.4 的PBS 沖洗，修復抗原，用過氧化物酶阻斷溶液，室溫下孵育，10 min 后加入一抗（鼠抗人NF-κB、β-catenin、c-myc單克隆抗體），室溫孵育過夜，加入二抗，室溫下孵育，10 min 后加鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液（50 μL）室溫下孵育，10 min 后加 DAB 顯色，復染，脫水、透明、封片，400 倍顯微鏡下觀察染色情況，選取5個視野，計算100個細胞。對染色強度與陽性細胞百分比進行評分。染色強度評分：無染色為0分，淡黃色為1 分，黃色為2 分，棕褐色為3 分。陽性細胞百分比評分：陽性細胞百分比<5%為0分，陽性細胞百分比5%～25%為1 分，陽性細胞百分比>25%～50%為2 分，陽性細胞百分比>50%～75%為3 分，陽性細胞百分比>75%為4分。以上兩項評分相加，≤2分為陰性，>2分為陽性。

1.3 角質形成細胞的提取及鑒定 根據參考文獻［6］采用無血清法提取角質形成細胞。取尖銳濕疣患者皮損組織及正常對照組正常包皮、宮頸組織，用PBS溶液（含慶大霉素50 μg／mL）浸泡，10 min后用PBS（含青鏈霉素100 U／mL）洗滌3 次，將以上組織剪成小塊用PBS 洗滌2次，加入Dispase 酶，于4 ℃過夜，吸出酶液PBS 洗滌2 次，加混合消化液（0.25%胰酶和0.01%EDTA），于37 ℃下5 min，用胰酶抑制劑終止消化，吹打成單細胞懸液，離心5 min 棄上清液，重懸細胞，將細胞接種至培養板中，細胞長至70%～80% 進行傳代。將培養好的細胞置于-196 ℃液氮中保存。經免疫組化染色，倒置顯微鏡下觀察細胞呈鋪路石狀，鑒定為角質形成細胞。

1.4 角質形成細胞增殖能力檢測 采用MTT 法。將原代角質形成細胞制成懸液，接種至96 孔板（200 μL／孔），每組設3 孔，孵育48 h。加入MTT 溶液（終濃度5 g／L），于培養箱中繼續培養4 h，用DMSO（20 μL／孔）終止反應，振蕩均勻，測定波長570 nm處的吸光度值。繪制細胞生長曲線。

1.5 角質形成細胞中 β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA 表達檢測 采用RT-PCR 法。提取角質形成細胞總RNA，用紫光分光光度計測定其純度與濃度，篩選光密度值260/光密度值280為1.8～2.0的樣品。按照RT-PCR 兩步法試劑盒說明書將總RNA 反轉錄為cDNA。以逆轉錄成的cDNA 為模板進行PCR 反應。反應體系（25 μL）包括 2×Ultasybr mix?ture（12.5 μL）、RNase free dH2O（9.5 μL）、cDNA（1 μL）、上游引物（1 μL）、下游引物（1 μL）。β-catenin反應條件：預變性95 ℃ 5 min；變性 95 ℃ 45 s、退火60 ℃ 45 s、延伸 72 ℃ 45 s，40 個循環；72 ℃ 10 min。NF-κB 反應條件：預變性 94 ℃ 4 min；變性 94 ℃30 s、退火55 ℃ 60 s、延伸72 ℃ 2min，30個循環；72 ℃2 min。c-myc 反應條件：預變性 95 ℃ 30s；變性95 ℃ 5 s、退火60 ℃ 30 s、延伸60 ℃ 30 s，40個循環；72 ℃ 2 min。GAPDH：預變性 95 ℃ 30 s；變性 95 ℃5s、退火 60 ℃ 30 s、延伸 60 ℃ 30 s，40 個循環；72 ℃2 min。所用引物由上海生物工程有限公司合成。用 2-ΔΔct法計算 β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA 的相對表達量。β-catenin 上游引物序列5′-GCGTGGA?CAATGGCTACTCAAG-3′、下游引物序列 5′-TAT?TAACTACCACCTGGTCCTC-3′；NF-κB 上游引物序列 5′-CTAGTCGAGATGGCGCTGCAT-3′、下游引物序列 5′-CGCGGATCCACTACAACAGGCA-3′；c-myc上游引物序列5′-CCTGGTGCTCCATGAGGAGA-3′、下游引物序列5′-CTCCAGCAGAAGGTGATCCAGA-3′；GAPDH 上游引物序列 5′-GCACCGTCAAGGCT?GAGGAC-3′、下游引物序列 5′-TGGTGAAGACGC?CAGTGGA-3′。

1.6 統計學方法 采用SPSS22.0 統計軟件。β-catenin、NF-κB、c-myc蛋白陽性表達率比較采用χ2檢驗；計量資料用±s表示，比較采用重復測量方差分析或方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組組織中 β-catenin、NF-κB、c-myc 蛋白表達 高危型組、低危型組組織中β-catenin 蛋白定位于細胞質與細胞核，正常對照組組織中β-catenin蛋白定位于細胞膜；各組組織中NF-κB 蛋白定位于細胞質；各組組織中c-myc 蛋白定位于細胞核。與正常對照組比較，高危型組、低危型組組織中β-catenin、NF-κB、c-myc 蛋白陽性表達率高（P均<0.05）；與低危型組比較，高危型組組織中β-catenin、NF-κB、c-myc 蛋白陽性表達率高（P均<0.05）。見表1。

表1 各組組織中β-catenin、NF-κB、c-myc蛋白表達情況［例（%）］

2.2 各組角質形成細胞增殖能力比較 培養24、48、72 h 各組角質形成細胞增殖能力比較差異無統計學意義（P均>0.05）；培養96 h，各組角質形成細胞增殖能力比較差異有統計學意義（P均<0.05），高危型組、低危型組細胞增殖能力高于正常對照組（P均<0.05），高危型組細胞增殖能力高于低危型組（P<0.05）。見表2。

表2 各組角質形成細胞的增殖能力（±s）

表2 各組角質形成細胞的增殖能力（±s）

組別高危型組低危型組正常對照組光密度值培養24 h 0.402±0.034 0.407±0.029 0.401±0.036培養48 h 0.414±0.028 0.411±0.023 0.408±0.019培養72 h 0.422±0.031 0.420±0.027 0.412±0.035培養96 h 0.467±0.034 0.435±0.038 0.421±0.029

2.3 各組角質形成細胞中β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA 表達比較 各組角質形成細胞中β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA 表達比較差異有統計學意義（P均<0.05）。高危型組、低危型組角質形成細胞中 β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA 相對表達量高于正常對照組（P均<0.05），高危型組角質形成細胞中β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA 相對表達量高于低危型組（P均<0.05）。見表3。

表3 各組角質形成細胞中β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA表達情況（±s）

表3 各組角質形成細胞中β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA表達情況（±s）

組別高危型組低危型組正常對照組n 32 38 30 β-catenin mRNA 1.895±0.043 1.507±0.037 0.604±0.030 NF-κB mRNA 1.205±0.146 0.792±0.153 0.445±0.106 c-myc mRNA 0.020 4±0.002 2 0.015 4±0.002 1 0.006 2±0.001 5

2.4 初診與復發患者角質形成細胞中β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA 表達比較 復發患者角質形成細胞中 β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA 表達高于初診患者（P均<0.05），見表4。

表4 初診與復發患者角質形成細胞中β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA表達情況（±s）

表4 初診與復發患者角質形成細胞中β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA表達情況（±s）

患者初診復發n 37 33 β-catenin mRNA 1.605±0.037 1.882±0.029 NF-κB mRNA 0.816±0.117 1.182±0.132 c-myc mRNA 0.016 7±0.002 4 0.019 2±0.001 9

3 討論

尖銳濕疣由HPV 感染導致肛周及生殖器部位發生的增生性病變，好發于性活躍人群（20～40 歲），是臨床比較常見的性傳播疾病。我國尖銳濕疣的發病率位居性傳播疾病的第三位，僅次于非淋菌性尿道炎、淋病［7］。與尖銳濕疣相關的HPV 亞型主要為6、11、16、18 型，HPV6/11 為低危型，HPV16/18 為高危型。低危型病毒（HPV6/11）主要引起良性病變，但高危型病毒（HPV16/18）則與惡性腫瘤相關，約95%的宮頸腫瘤可檢測到HPV DNA［8］。目前雖然尖銳濕疣的治療方法較多，但其復發率一直居高不下，嚴重影響患者生理與心理健康。本研究對尖銳濕疣皮損組織及角質形成細胞中β-catenin、NF-κB、c-myc 的表達進行檢測，觀察三者的表達變化，以期為尖銳濕疣的臨床診治及預防復發提供參考。

β-catenin 是新原癌基因的產物，可與20 多種蛋白質結合，參與多種細胞的增殖和分化。β-catenin是一種重要的細胞黏附分子和細胞骨架成分，也是Wnt信號通路中的關鍵組成部分。β-catenin 可在細胞內形成不同類型的復合體。因此其發揮的生物學功能也不同，其復合物可通過酪氨酸激酶和磷酸酯酶的活性調節平衡，影響細胞遷移及細胞間黏附；可調控細胞質游離的β-catenin 水平及其進入細胞核的量及上百種靶基因的轉錄［9-10］。有研究探討β-catenin 蛋白表達與腦膠質瘤患者病理分級的關聯，結果顯示腦膠質瘤組織中β-catenin 蛋白呈高表達，與患者病理分級存在直接關聯［11］。何旭等［12］研究證實，miR-21可能通過調控β-catenin表達，從而促進非小細胞肺癌患者病情進展，縮短其生存時間。研究結果顯示在尖銳濕疣發病過程中，β-catenin mRNA表達異常，細胞周期發生改變［6］。

NF-κB 與多種相關基因轉錄調控有關，參與多種腫瘤的發生發展過程。NF-κB 可拮抗細胞凋亡；細胞周期蛋白 Dl 是 G1～S 期的正性調控因子，NF-κB可促進細胞周期蛋白Dl 的表達，從而促進細胞增殖。尖銳濕疣的發病還與感染者免疫功能異常相關，而TLR在免疫應答中起重要作用。TLR9可抗病毒感染。NF-κB 可作用于靶基因，促進各種炎癥相關因子表達。TLR9 可激活 NF-κB 和子蛋白 1 釋放多種炎癥相關因子參與免疫應答［13］。多項研究結果顯示，NF-κB 在多種腫瘤組織中高表達［14-17］。NF-κB通過促進細胞增殖和血管生成、免疫逃逸和抑制凋亡來參與尖銳濕疣的發生發展［18］。

原癌基因是一種正常細胞基因，可編碼關鍵性調控蛋白，其在正常表皮中呈表達狀態，可抑制細胞增生及誘導細胞分化。c-myc 是一種原癌基因，目前有關其在惡性腫瘤中激活的研究較多，在尖銳濕疣中的表達研究較少。研究發現，宮頸癌中c-myc蛋白呈高表達［19］。在子宮內膜樣腺癌［20］、結腸癌［21］、鼻咽癌［22］、乳腺癌［23］組織中也呈高表達。研究發現，c-myc 主要表達于正常人表皮細胞基底層，而在尖銳濕疣皮損中，其分布于除角質層以外的表皮各層（基底層、棘層及顆粒層），陽性信號定位于細胞核［24］，這與HPV作用于角質形成細胞的分布一致。

本研究首先用免疫組化法檢測β-catenin、NF-κB、c-myc 蛋白在尖銳濕疣皮損組織中的表達，結果顯示，高危型組、低危型組組織中β-catenin、NF-κB、c-myc 蛋白陽性表達率高于正常對照組，且高危型組組織中三種蛋白的陽性表達率最高。說明三者參與了尖銳濕疣的發生發展過程，且其表達變化與病毒分型有關。為進一步驗證該結果，提取了角質形成細胞。HPV 最初感染的是角質形成細胞，細胞內病毒DNA 呈低水平合成狀態，逐步建立穩定水平的病毒基因組，細胞恢復自身生長周期，然后使病毒周期進入生產階段。角質形成細胞是炎癥反應始動者，與其他免疫細胞相互作用產生炎癥信號網絡通路影響自身增殖分化及皮膚局部炎癥反應［25］。本研究用MTT 法檢測角質形成細胞增殖能力，結果顯示高危型組細胞增殖能力>低危型組>正常對照組，可見感染HPV 的角質形成細胞存在異常增殖。用RT-PCR 法檢測角質形成細胞中 β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA表達，高危型組角質形成細胞中β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA 相對表達量最高，正常對照組角質形成細胞中 β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA 相對表達量最低。提示 β-catenin、NF-κB、c-myc 可能參與了角質形成細胞的增殖過程。另外，本研究對β-catenin、NF-κB、c-myc 與患者復發的關系也進行了探討，復發患者角質形成細胞中β-catenin、NF-κB、c-myc mRNA表達高于初診患者。說明，尖銳濕疣復發可能與β-catenin、NF-κB、c-myc有關。

綜上所述，尖銳濕疣皮損組織及角質形成細胞中β-catenin、NF-κB、c-myc 呈高表達，三者表達變化與HPV 分型及復發有關。但本研究也存在不足，所選患者樣本數較少，也未對β-catenin、NF-κB、c-myc在尖銳濕疣分型及復發中的作用機制深入探討，后期研究將擴大樣本進一步探討其作用機制。