QuEChERS-固相萃取-氣相色譜/四極桿飛行時間質譜法快速測定牛奶中的11種有機磷

陳錦杭，馮城婷，林秋鳳，義志忠，鄭耀林，張樹權，區碩俊，曾廣豐

(1.東莞市食品藥品檢驗所，廣東 東莞523808；2.廣州檢驗檢測認證集團有限公司 國家加工食品質量檢驗中心，廣州511447；3.廣州海關技術中心 廣東省動植物與食品進出口技術措施研究重點實驗室，廣州510623)

0 引言

有機磷農藥是一種殺蟲劑，具有殺毒效果高、廣譜性強等特點，在蔬菜和水果種植中受到了廣泛的應用[1-4]。其中在水果和蔬菜中均有廣泛的應用[5-7]。長期低劑量的暴露可能引發神經毒性、遺傳毒性、生殖發育毒性等多種不良影響[8-9]。有機磷殘留物也可能會通過牛羊等牲畜的飼料進入動物體內，從而在動物源性的食品中殘留，進一步被人體攝入[10]。

目前，對有機磷類農藥的測定方法主要有氣相色譜法[11-12]、氣相色譜-質譜法[13-14]，液相色譜[15]和液相色譜-串聯質譜法[16-19]，還有酶聯免疫法[20]。本文基于QuEChERS和固相萃取（SPE）技術建立了測定牛奶中的11種有機磷農藥的GC-Q-TOF/MS法，該方法操作簡便、快速高效且回收率高、重現性好，適用于實驗室的日常分析測定，為相關檢測方法的研究提供了參考依據。

1 實驗

1.1 儀器與試劑

氣相色譜-四級桿/飛行時間質譜（安捷倫7200B），配有電子轟擊離子源（Electron ionization,EI）及Qualitative Analysis B.07.00,Q-TOF Quantitative Analysis數據處理系統安捷倫科技(中國)有限公司；超純水系統（Milli-Q Advantage A10），法國Merck Millipore公司；搖床（Promax 2020），德國Heidolph Brinkman公司；高速離心機（TGL-16M），湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；渦旋振蕩器（Heidolph Multi Reax），德國Heidolph公司。

乙腈、乙酸乙酯（色譜純），賽默飛世爾公司；檸檬酸鈉，無水硫酸鎂，氯化鈉，檸檬酸氫二鈉（分析純），安譜公司。

速滅磷、甲拌磷、二嗪磷、甲基對硫磷、殺螟硫磷、水胺硫磷、溴硫磷、殺撲磷、p,p'-DDE、三唑磷、p,p'-DDT（固體標樣，純度≥98.5%）標準品，購自上海安譜科學儀器有限公司）。

1.2 標準溶液的配置

標準儲備溶液：分別稱取11種標準物質0.0100 g，甲醇定容至10 mL容量瓶，分別配制成1 000 mg/L的標準儲備溶液。

混合標準中間液：分別準確移取100μL質量濃度1 000 mg/L的標準儲備溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成質量濃度為10 mg/L的混合標準中間液。

混合標準工作曲線：分別取上述混合標準中間溶液10，20，50，100，200，500μL于10 mL容量瓶中，用空白基質液稀釋至刻度，所得混合標準工作曲線質量濃度分別為10，20，50，100，200，500μg/L。

1.3 樣品前處理

提取：稱取牛奶樣品10.0 g，依次加入10 mL乙腈，1.0 g檸檬酸鈉，4.0 g無水硫酸鎂，1.0 g氯化鈉，0.4 g檸檬酸氫二鈉，置于搖床震蕩15 min，然后以轉速10 000 r/min離心5 min。吸取上清液5 mL到氮吹管，40℃氮吹至近干，加入2 mL乙酸乙酯，渦旋混勻，繼續氮吹至近干，再加入1 mL乙酸乙酯，渦旋，氮吹至0.5 mL。

凈化：用4 mL的乙酸乙酯活化GCB固相萃取小柱（3 mL，250 mg），把濃縮的樣液加到GCB柱，用3 mL的乙酸乙酯分3次洗脫，收集洗脫液，40℃氮吹至近干，用乙酸乙酯定容至1 mL，過0.22μm有機相濾膜，供儀器測定。

1.4 色譜及質譜條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱：安捷倫DB-5ms石英毛細柱(30 m×0.25 mm，0.25μm，購于安捷倫上海公司)；升溫程序：80℃保持1 min，以5℃/min升至180℃，保持7 min，以10℃/min升至260℃保持2 min，以20℃/min升至300℃保持9 min；載氣(He)流速1.5 mL/min，接口溫度為295℃，進樣量1μL；不分流。

1.4.2 質譜條件

電子轟擊(EI)離子源；電子能量70 eV；四極桿溫度150℃；離子源溫度280℃；溶劑延遲為5 min；工作模式：全掃描；質量掃描范圍：m/z 60～550 amu；掃描速率：5 spectra/s，高分辨模式。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

由于分析化合物較多，盡管高分辨飛行時間質譜定性能力較強，但對于某些化合物，如同分異構體2,4-DDT和4,4-DDT，有可能產生相同的碎片離子，從而影響定量的準確性，所以有必要對化合物進行分離，同時也是為了降低基質效應對定量結果的影響。本實驗比 較了DB-5ms、HB-5ms以及PH-5ms色譜柱，使用HB-5ms和PH-5ms的色譜柱難以分離水胺硫磷和溴硫磷，而且峰型較差，難以滿足分析的要求。本實驗最后發現DB-5ms色譜柱分離效果最好，9種有機磷能同時分離，且具有良好的分離度，滿足檢測的要求，因此本實驗選用DB-5ms。由于水胺硫磷、殺螟硫磷和殺撲磷比較難分離，本研究調整了升溫程序，使用2個升溫梯度，成功對9種有機磷同時進行分離，并成功獲得良好的分離效果，11種有機磷提取色譜如圖1所示。

圖1 11種有機磷目標物酯的提取離子流色譜

2.2 GC-Q-TOF/MS分析方法的建立

本實驗先通過全掃描模式，對11種目標有機磷農藥進行采集，得到全掃描質譜圖，建立了TOF全掃描精確質量數的數據庫。同時確定每種化合物的保留時間，兩者結合進行準確的定性分析。再根據目標農藥碎片離子的豐度確定定量離子，同時選擇特征離子組合（見表1）進行SIM模式掃描。根據其標準物質和待測樣品的SIM離子流圖中的峰面積，最后通過外標法定量分析。

表1 11種有機磷農藥的質譜峰碎片參數

2.3 固相萃取柱類型的選擇

牛奶樣品中含有較多的糖、蛋白質、氨基酸和干擾性雜質，對11種有機磷目標物產生較大的基質效應，從而干擾實驗的進行。本研究采用GCB、PSA和C18固相吸附劑對處理后的溶液進行凈化。實驗結果顯示，11種有機磷目標物中，有一部分具有胺基結構，因此PSA對其具有較明顯的吸附作用，導致回收率降低，其次是C18，對11種有機磷也有一定的吸附作用。而GCB對目標物的吸附較少，并且能較好地去除基質對分析結果的影響，基質效應也較弱。本實驗最終選取GCB進行凈化，結果如圖2所示。

圖2 不同固相萃取柱對回收率的影響(n=6)

2.4 乙腈用量對回收率的影響

實驗前期優化時發現，搖床振搖15 min以上基本完成提取，因此不對提取時間作詳細探究。在以純水用量為5 mL的條件下，對乙腈用量對回收率的影響進行了探究，并以11種有機磷的平均回收率為考察依據。結果發現，當乙腈用量為10 mL時，11種有機磷的回收率基本滿足測定要求，而用量繼續增加，回收率沒有明顯變化。雖然乙腈用量越多，稀釋倍數越大，因此基質效應也會相對較弱，但同樣方法檢出限也會越高，氮吹時間，檢測成本等也會消耗較大。因此，綜合考慮，選取10 mL為乙腈提取用量。結果如圖3所示。

圖3 乙腈用量對回收率的影響(n=6)

2.5 基質效應的討論

由于牛奶中含有大量的糖和氨基酸，還有其他雜質，在提取過程中，會被提取到乙腈層，同時也難以在凈化過程中完全除去，因此會在質譜分析的過程中，與目標物進行離子化競爭，從而有可能影響目標物的離子化程度而產生基質效應。本文以空白基質曲線的斜率與純溶劑曲線的斜率比值K為參考依據，以討論方法的基質效應程度，當K值在0.9～1.1之間時，說明基質效應不明顯；K值小于0.9時，基質負效應明顯；K值大于1.1時，基質正效應明顯；實驗結果表明，12種有機磷的K值在0.56～0.81之間，說明基質負效應較明顯，因此，最終選擇采用基質曲線進行定量。

2.6 線性關系

本研究使用外標法，對11種目標物進行定量分析。以空白基質溶液來配制標準系列曲線，在經優化后的儀器條件下進行測定。測得結果以濃度為橫坐標(X)和定量離子對的峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸，實驗結果表明，所有目標物在10～500μ/L范圍內呈良好線性，相關系數R2均大于0.9984。其中，方法檢測限LOD（S/N=3）為1.56～7.85μg/kg，定量限LOQ（S/N=10）為5.51～26.89μg/kg。結果如表2所示。

表2 11種有機磷農藥的線性方程、相關系數（R2）和檢出限

2.7 回收率及精密度結果分析

選用空白樣品，以質量分數10，20，50μg/kg，進行3個水平的加標回收實驗，每個加標水平分別日內進行6次平行測定。平均回收率范圍在73.6%～95.4%之間，相對標準偏差（RSD）在2.48%～6.30%之間。本實驗結果說明該11種有機磷的回收率良好，日內重復性好，能滿足分析測定要求，結果如表3所示。

表3 11種有機磷農藥的回收率和精密度

3 結論

本研究基于QuEChERS技術進行提取，結合SPE固相萃取柱進行凈化，使用GC-Q-TOF/MS建立了快速測定牛奶中11種有機磷農藥的測定方法。利用GCB對樣品提取液進行凈化，有效地降低了基質效應對回收率的影響，提高了方法的靈敏度；在優化的氣相色譜條件下，11種有機磷農藥在35 min內全部出峰，且完全分離，峰型良好；結合GC-Q-TOF/MS，準確測定了11種有機磷定性定量離子對的精確分子量，極大程度的降低了假陽性的可能；相關方法學實驗結果表明，本方法簡單便捷，回收率好且精密度高，為有機磷類農藥殘留量的檢測方法研究提供了重要參考數據。