腐植酸在減輕砷對植物毒害方面的作用機理研究

萬屾騰 白 瑜 李 林，2，3 蔡志鋒，2，3 侯玲杰，2，3 張彩鳳，2，3

1 太原師范學院化學系 晉中 030619

2 山西省腐植酸工程技術研究中心 晉中 030619

3 山西省有機旱作農業肥料工程研究中心 晉中 030619

腐植酸（HA）可用作廣譜植物生長調節劑以促進植物生長發育、增強植物抗逆性、提高植物產量和改善植物品質等。此外，HA還具有吸附、絡（螯）合、離子交換、膠體等理化性質，可以使土壤疏松，改善土壤理化性質，修復重金屬污染土壤等作用，如砷（As）。Mukhopadhyay等[1]研究表明，HA與As（V）的結合物相當穩定。Cormu等[2]研究認為，在pH大于5時，含HA的高嶺土吸附As（V）的量大于不含HA的高嶺土。Grafe等[3]研究認為，在酸性條件下，HA能降低針鐵礦對As（III）的吸附。這些研究結果為減輕土壤活性As（III）和As（V）的含量，降低As（III）和As（V）對作物的生物有效性提供了理論依據。同時，HA類物質均能夠促進植物的生長發育和對營養元素的吸收，提高其抗逆性和適應性，改善植物產品品質，增產效果顯著[4]。郭云征等[5]報道一種農牧產品有害物質消除劑及其應用，用于消除動植物體內有害物質超標的問題，該消除劑主要成分為HA。

國內外關于土壤As（III）和As（V）污染對植物影響的研究一直是熱點。HA能夠增加植物的葉綠素含量和強化其光合作用能力，也可以和土壤中重金屬離子形成絡合物，從而抑制重金屬進入植物，進而增加農作物產量。本文通過相關文獻搜集，總結As對植物的影響、HA在減輕As對植物毒害方面的作用機理，以期為相關研究領域提供參考。

1 As（III）和As（V）對植物的影響

不同形態的As毒性不同，依毒性大小依次為As（III）＞As（V）＞二甲基砷＞單質As[6，7]。單質As因其難溶解能力而顯現出非常低的生理毒性，無機As因其移動性特別強而顯現出非常強的生理毒性，其中，As（III）的生理毒性最為強烈，依次約為As（V）和二甲基砷的60和70倍[8]。楊桂娣等[9]的研究表明，As（III）對水稻種子的生理毒性要明顯強于As（V）。

1.1 微量As（III）和As（V）對植物的促進作用

As并非植物生長必需的營養元素，但一些研究表明，微量的As（III）、As（V）能有助于植物的生長發育[10～12]。安堃達等[13]試驗表明，土壤As（V）濃度在50 mg/kg的情況下有助于西紅柿植株的生長，其生物量和產量分別為對照組的1.56倍和1.51倍。郭再華等[14]試驗證明，土壤中微量As（V）有助于水稻的生長發育和對磷元素的吸收。趙天宏等[15]試驗發現，當環境中低濃度As（III）存在時，水稻本能表現出自我保護作用。

1.2 過量As（III）和As（V）對植物的毒害作用

As（III）和As（V）對植物的毒效應可能是通過影響植物的水分運輸和養分吸收，破壞了植物細胞內部的葉綠素，影響其生長發育，導致產量降低，植物產品質量變差。楊桂娣等[9]的研究表明，As（III）和As（V）都可以顯著地抑制水稻種子的發芽比例、根系長短和含水比例等關鍵性指標。常思敏等[16]研究表明，土壤As（V）抑制烤煙的生長發育，降低烤煙產量和品質，從而降低烤煙的經濟性和商業價值。劉全吉等[17]研究表明，土壤As（V）含量為200 mg/kg對冬小麥生長發育有顯著的抑制作用，使植株高度、地上部分生物量、根系生物量及產量較對照組分別減少17.0%、52.2%、60.6%和46.8%。在水培條件下，As（V）對小麥的生長發育也存在較強的毒性，這是因為As（V）抑制小麥的根系生長和磷元素吸收，從而減弱根系活力和降低生物量[18]。

1.3 As（III）和As（V）對植物毒害的機理

研究表明，As易與胞內巰基生物分子結合[19]，例如As（III）能夠和巰基進行配位，其比例約為1∶3，該絡合物有相對較大的穩定系數，不易被破壞[20]。As（III）與巰基配位形成絡合物后會降低多種生物酶活性，如谷胱甘肽還原酶、谷胱甘肽氧化酵素、硫氧還蛋白還原酶及硫氧還蛋白過氧化物酶，進而導致一系列毒性效應[21]。As（III）和As（V）大多是經較大孔徑的通道蛋白進入細胞內，植物生長土壤環境中如有較高含量的As（III）和As（V），會破壞細胞結構并產生較強副作用[22]。無機As（III）和As（V）在進入細胞后通過影響代謝過程對植物造成傷害：（1）氧化損傷，釋放較多的活性氧中間體，迫使細胞里面進行過氧化反應，破壞蛋白質、脂類以及核酸等胞內物質，引發脂質過氧化效應，脂質膜的過氧化將會破壞細胞膜的結構和功能，最終引發細胞凋零[23]；（2）抑制二磷酸核酮糖羧化酶、葉綠素的生物合成、光合色素合成以及光合作用；（3）通過解偶聯磷酸化抑制ATP合成[23]。

2 HA在減輕As（III）和As（V）對植物毒害方面的作用機理

2.1 HA通過影響氮代謝減輕As（V）對植物的毒害

氨基酸是合成蛋白質的主要原料，也是蛋白質降解的主要產物，是反映氮代謝的主要指標。谷氨酰胺合成酶（GS）等酶類把植物體內的NH4+-N循環同化為谷氨酰胺和谷氨酸后，由谷氨酸-丙酮酸轉氨酶（GPT）等轉氨酶類轉化為其他氨基酸。天冬酰胺酶（ASG）催化天冬酰胺水解生成天冬氨酸和氨，其活性變化一方面反映氮代謝狀況，另一方面生成氨多少與植物在逆境條件下遭受氨中毒的程度呈正比。精氨酸是抗氧化性氨基酸，具有良好的清除自由基能力[24]，是生成多胺、一氧化氮和谷氨酸等的前體物質，而多胺、一氧化氮是植物體內重要的信使分子，參與生長發育、抗逆等幾乎所有的生理生化過程[25]。

常思敏等[26]在研究As（V）污染土壤中加入HA的小分子組分——黃腐酸（FA），觀察烤煙氮代謝及其過程，結果顯示，FA可改善烤煙全生育期硝酸還原酶（NR）活性，減弱GS的活性。由此得出As（V）污染土壤中加入FA可改善烤煙NO3--N的同化能力，降低其NH4+-N的同化能力，從而減輕土壤As（V）對烤煙氮同化的毒害；通過考察As（V）污染土壤中施用FA對烤煙氮轉化代謝影響表明，除團棵期FA處理稍微刺激As（V）毒害烤煙的谷丙轉氨酶（GPT）活性外，FA降低了現蕾以后的GPT活性、全生育期的ASG活性和游離氨基酸的積累，從而減輕了As（V）對烤煙的毒害。根據Newton等[27]對HA使As（V）污染土壤種植烤煙氮轉化代謝旺盛的研究結果推斷，As（V）污染土壤中施用HA可抑制烤煙因As（V）毒害產生的氮轉化衰弱問題，減輕了As（V）對烤煙氮轉化方面的毒害。王琦等[28]通過研究HA調節砷酸鹽生菜毒性作用表明，應對As（V）脅迫的主要差異表達氨基酸類型為谷氨酸和精氨酸，HA可以上調二者的表達水平，從而緩解高濃度的As（V）對生菜的毒性作用。

2.2 HA通過介導作用減輕As（III）和As（V）對植物的毒害

介導作用，也稱為網格蛋白介導的內吞作用，是一種細胞通過質膜向內萌芽（內陷）吸收代謝產物、激素、蛋白質和某些病菌的過程。這個過程形成含有被吸收物質的囊泡，并嚴格由細胞表面的受體介導。只有受體特異性物質才能通過這個過程進入細胞。研究HA介導作用不僅利于我們科學評估天然有機質的生態調控作用，同時利于我們明晰水環境中污染物的物化歸趨。

（1）HA-As（III）-硅藻共存體系的微觀界面調節機制。

圖 1 HA-As(III)- 硅藻共存體界面作用示意圖Fig.1 Schematic diagram of interface action on coexistence system of humic acid, As(Ⅲ) and diatom

研究報道該調節機制如圖1[29]所示，HA吸附在植物胞壁外表面構筑一層特殊的保護膜。HA會對細胞膜的電化學特征和離子傳輸通道產生一定程度的影響，繼而改變細胞對重金屬的吸收效果。倪燕燕[29]探究了硅藻細胞吸附態HA造成的表面特征的原因。其研究結果表明，HA在硅藻細胞外的吸附作用異常強烈，當HA含量在20 mg/L以下時，該吸附效果匹配線性吸附模型，亨利常數KH約為2.35±0.55×10-8L cell-1。當HA含量在60 mg/L以上時，吸附效果則會達到極限狀態。硅藻胞壁的掃描電鏡圖顯示吸附態HA能夠遮蔽細胞壁的微孔結構，并構筑胞壁外絮狀層進而減弱細胞膜的滲透性能。另外，紅外光譜分析顯示-COOH是HA與As（III）在硅藻胞壁外層吸附的共同作用基團，吸附態HA占用了As（III）的部分活性吸附位點。由于以上各方面作用的共同存在，HA能夠減少As（III）在硅藻胞壁外的吸附。

（2）不同濃度梯度HA的介導作用存在差異。倪燕燕[29]探究了不同HA濃度梯度介導作用下As（III）對硅藻細胞生理毒性的差異性，如果HA含量在20 mg/L以下，As（III）對硅藻細胞的生長發育有一定程度的促進，如果HA含量在40 mg/L以上，As（III）將對硅藻的生長發育表現出顯著的阻礙現象。含量在20 mg/L的時候，HA對As（III）的生理毒性影響效率處于最佳狀態。HA介導作用存在差異的機制源自于調節了硅藻細胞內的活性氧比例，10 mg/L和20 mg/L的HA介導作用下，經As（III）處理的舟形藻細胞里面活性氧比例依次減少約12.64%和5.95%。該現象的深層次原因可能是，處于低含量As（III）的環境中，HA對細胞生長發育的促進作用可以減弱As（III）的生理毒性，雖然HA單獨使用后硅藻細胞的生長發育會有較低程度的促進，它仍可以催化硅藻細胞里面的氧化應激系統。

（3）離子界面的競爭吸附作用對減輕As對植物毒害。

試驗結果顯示，As（III）和As（V）和其他重金屬的生理毒性，源自水生生物吸收周圍環境中Na+、Cl-和Ca2+等的阻礙現象，當環境中重金屬的含量偏高時，它們會堵塞離子傳輸路徑并提高離子滲出率[30]。文獻報道關于HA對Na+、K+和Ca2+的吸收動力學的影響，HA通過提高Na+活性吸收的極限容量來促進Na+跨膜運輸，該現象和Glover等[31]的試驗結果一致。HA會增加植物細胞中Na+、K+與有關酶的生物活性，還能夠促進離子遷移相關酶的生物活性，從而降低As（III）和其他重金屬的對植物的毒性。

2.3 HA通過降低土壤As生物有效性減輕As對植物的毒害

HA是一類復雜的有機混合物，其化學結構里面包含有多種有機官能團，比如-COOH、-OH和-NH2等。HA與金屬離子的吸附和絡合作用直接影響了重金屬的毒性。HA通過絡合作用抑制重金屬遷移，減輕對植物危害。隨著HA施用濃度的增加，作物積累的重金屬含量隨之降低。Saada等[32]研究表明，HA中除含有大量苯環外，還含有大量-COOH等官能團，分子表面呈孔狀結構，增加了吸附表面積，同時HA中大量的活性基團為As的吸附提供了更多的吸附位點，從而限制植物對As的吸收。相關研究顯示HA能夠和As（III）經由配體交換進行分子耦合而產生As-HA絡合物，由此減少植物生長環境里面可利用的As（III）含量。Perassi等[33]研究表明，HA在固定As的同時，還會與磷肥形成HA-磷酸鹽絡合物，絡合物既能防止土壤對磷的固定又有利于植物吸收磷，促進植物的生長發育。

土壤組成成分、pH以及外界引入土壤的競爭離子等因素均會影響土壤對As的吸附[34]。其中不同形態的As在土壤中是可以相互轉化的，其轉化過程與氧化-還原、溶解-沉淀、甲基化-脫甲基以及生物富集等過程密切相關。隨pH的增高，土壤對As的吸附量減小，隨著Eh（氧化還原電位）值的減小和pH的升高，As的可溶性顯著增加。As（III）和As（V）隨Eh值改變而相互轉化。由于土壤對As的吸附作用，植物吸收的可利用量并不能通過土壤中的總As濃度來反映。相較于總量，土壤中As的存在形態更重要，其決定了As的生物有效性和毒性[35]。在典型環境狀況下，As（III）基本上是以HAsO2化合物存在，少量會以存在于土壤或水體，由于HA呈電負性，有研究表明，As能夠經由金屬橋（例如Fe、Mn）與HA形成As-M-HA三聚絡合物[36～38]，從而抑制As對植物的毒害作用。王俊等[39]表明，在添加量≤1% C時FA和HA均可提高交換態As的分配比例，FA能顯著促進土壤As由鋁型As和鐵型As向殘渣態As轉化，且隨用量的增加轉化作用增強，而HA的這種作用強度較弱，在HA添加量為5% C時甚至表現出相反的作用。劉利軍等[40]研究表明，在高pH土壤條件下，HA可以顯著降低溶解性As的含量，當HA用量為10 g/kg土時，可以有效降低As對植物的毒害作用。

研究還發現，HA與重金屬間存在復雜的化學平衡，且HA直接或間接地向植物細胞供給有機碳源，刺激植物的生長發育，顯示出對重金屬生理毒性的緩解功能[41]。

3 結論與討論

近年來，隨著土壤As污染研究的深入，土壤As污染的植物修復逐漸成為研究熱點，特別是在減害的栽培措施方面頗有成效。本文主要綜述了砷的各種形態對植物的毒害程度，依毒性大小依次為As（III）＞As（V）＞二甲基砷＞單質As；HA在減輕As對植物毒害方面的作用機理，包括影響氮代謝、介導作用、降低土壤As生物有效性的作用機理。目前，雖然已有一些關于HA對As污染植物毒性影響的分子生物學和細胞機制的研究，但仍然需要進一步明確其影響機制。可借助先進的分子生物學手段，從基因與蛋白分子水平精準考察As污染植物毒性作用機制。