慢性阻塞性肺疾病患者血清mir-210、HIF-1α表達水平及意義

蔡燕

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)簡稱慢阻肺，是一種常見的慢性呼吸系統疾病，主要臨床特征為呼吸氣流受限[1]、咳嗽、胸悶，其中急性加重期患者若病情控制不當，可能發展為肺功能衰弱，最終導致呼吸衰竭[2]。據報道低氧和氣道炎癥是COPD疾病的相關影響因素[3]。缺氧誘導因子1α(hxpoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)在低氧狀態下的細胞中能夠高表達，能夠適應機體缺氧，參與缺氧性肺動脈高壓、炎性因子的表達等[4]，在COPD疾病發生發展中起到重要推動作用。另有相關文獻報道miRNA能通過調節平滑肌細胞中促炎因子釋放，導致肺部疾病病情加重[5]。然而有關mir-210和HIF-1α在水平變化對COPD疾病影響研究較少，本文擬探究mir-210、HIF-1α在COPD血清表達情況，并分析其在早期預防COPD的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院2016年10月至2018年10月收治的COPD患者88例，其中急性加重期(急性加重期COPD組)43例，男24例，女19例；年齡55～70歲，平均年齡(61.20±9.34)歲；穩定期(穩定期COPD組)45例，男25例，女20例；年齡50～75歲，平均年齡(64.50±6.87)歲。選取本院體檢健康者45例，男25例，女20例；年齡48～76歲，平均年齡(65.30±8.64)歲。3組年齡、性別比差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 納入與排除標準 納入標準：(1)符合COPD診治指南(2013年修訂版)；(2)1個月內無胸腔及其他手術者；(3)近3個月未注射免疫抑制劑者；(4)自愿參與本臨床試驗，同意簽署臨床研究協議書。排除標準：(1)患有腎、肝、心功能障礙患者；(2)患有有關支氣管擴張、支氣管哮喘、肺部疾病患者；(3)患有其他部位感染患者；(4)有長期激素治療患者；(5)精神疾病患者。本研究通過本院倫理委員會批準，符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》。

1.3 主要試劑及儀器 人HIF-1α ELISA試劑盒，上海廣銳生物科技有限公司；逆轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒，德國Promega公司；RNA提取試劑盒，日本TaKaRa公司；Masterscreen Diffusion型肺功能檢測儀，德國JAEGER公司；278型血液氣體分析儀；美國康寧；Multiskan Sky全自動酶標儀、PikoReal熒光定量PCR儀，美國賽默飛世爾公司；eppendorf冷凍低速離心，德國Eppendorf公司。

1.4 方法

1.4.1 樣本采集:所有受試者入院后或體檢當天空腹采集靜脈血8 ml，靜置10 min，3 000 r/min，4℃，10 cm半徑離心20 min。收集上清液。

1.4.2 指標檢測:①HIF-1α水平檢測：依照人HIF-1α ELISA試劑盒操作步驟采用酶聯免疫法檢測血清HIF-1α水平。②肺功能檢查：用肺功能儀檢測用力肺活量(forced vital capacity，FVC)、第1秒用力呼氣量占用力肺活量比值(FEV1/FVC)、用力呼氣中期流速(maximal mid-expiratory flow curve，MMEF)和呼氣峰值流速(peakexpiratoryflow，PEF)。③血氣分析：用肝素化注射器抽取所有受試者橈動脈血0.5 ml，用血液氣體分析儀進行血氣分析。

1.4.3 熒光定量PCR檢測血清mir-210的表達水平:用RNA試劑盒提取血清中總RNA，核算蛋白分析儀測定260/280值為1.9～2.0，證明RNA濃度良好。反轉錄cDNA，保存于-20℃備用。mir-210和內參引物送與上海生工合成。qRT-PCR反應體系20 μl：2×STBR Master Mix 12.5 μl，模板cDNA(50 ng/μl)1 μl，正向引物 1.0 μl，反向引物1.0 μl，ddH2O 4.5 μl。反應條件：95℃，5 min；95℃，20 s；62℃，30 s；72℃，35 s；30個循環。對mir-210相對表達量用2-ΔΔCT法計算。見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結果

2.1 穩定期COPD組和急性加重COPD組血清miR-210表達水平和HIF-1α水平 對照組、穩定期COPD組、急性加重期COPD組患者血清mir-210表達水平和HIF-1α水平，兩兩比較差異有統計學意義(P<0.05)。與對照組比較，穩定期COPD組、急性加重期COPD組患者血清mir-210表達水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，HIF-1α水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與穩定期COPD組比較，急性加重期COPD組患者血清mir-210表達水平明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)，HIF-1α水平明顯上升，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 COPD患者血清miR-210表達水平和HIF-1α水平比較

2.2 3組血氣指標比較 與對照組比較，穩定期COPD組、急性加重期COPD組患者血氣指標PaO2顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，PaCO2顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，與穩定期COPD組比較，急性加重期COPD組患者血氣指標PaO2顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)，PaCO2顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 3組血氣指標比較

2.3 2組肺功能FVC、FEV1/FVC、MMEF和PEF指標比較 與對照組比較，穩定期COPD組、急性加重期COPD組患者肺功能指標FVC、FEV1/FVC、MMEF和PEF顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)，與穩定期COPD組比較，急性加重期COPD組患者肺功能指標FVC、FEV1/FVC、MMEF和PEF顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 2組肺功能指標比較

2.4 COPD患者血清miR-210表達水平與HIF-1α水平相關性分析 Pearson相關性分析顯示COPD患者血清miR-210表達水平與HIF-1α水平呈負相關(r=-0.648，P<0.05)。見圖1。

圖1 COPD患者血清miR-210表達水平與HIF-1α水平相關性分析

2.5 COPD患者血清mir-210表達水平、HIF-1α水平與肺功能、血氣指標的相關性分析 COPD患者血清mir-210表達水平與FVC、FEV1/FVC、MMEF、PEF、PaO2水平呈正相關(P<0.05)，與PaCO2水平呈負相關(P<0.05)。COPD患者血清HIF-1α水平與FVC、FEV1/FVC、MMEF、PEF、PaO2水平呈負相關(P<0.05)，與PaCO2水平呈正相關(P<0.05)。見表5。

表5 Pearson相關性分析

3 討論

COPD是一種臨床上常見肺部慢性疾病，多以低氧血癥為先發征兆[6]。有研究報道炎性反應、氧化應激反應等在COPD發生發展過程中發揮作用，然而COPD發病機制復雜，具體機制不清楚[7]。

據報道COPD患者呼吸功能與炎性因子有關，肺功能指標和血氣指標可評價患者呼吸功能，其中FEV1/FVC和PEF可反應氣道阻塞的程度[8]，PaO2可反映患者血氧分壓。馬原等[9]研究發現COPD患者肺功能指標FVC、FEV1/FVC、MMEF、PEF和血氣指標PaO2顯著降低，PaCO2顯著上升。劉林林等[10]研究發現急性加重期COPD患者血氣指標PaO2顯著下降，PaCO2顯著上升。徐繼勛等[11]發現COPD患者肺功能指標FVC、FEV1/FVC、MMEF、PEF顯著低于對照組。本研究發現，穩定期COPD組和急性加重期COPD組患者FVC、FEV1/FVC、MMEF、PEF和PaO2顯著低于對照組，PaCO2顯著高于對照組，提示COPD疾病可能對機體呼吸功能有影響，COPD患者均存在一定程度呼吸功能障礙。與穩定期COPD組比較，急性加重期COPD組患者FVC、FEV1/FVC、MMEF、PEF和PaO2顯著降低，PaCO2顯著升高，提示呼吸功能受損害程度可能與COPD病情進展有關。

雖然肺功能指標能一定程度評估COPD患者病情，但預測患者病情靈敏度具有一定局限性[12]。HIF-1α水平能夠反映機體缺氧缺血程度，HIF-1α也能夠誘導細胞缺氧環境形成。陶洪臣等[13]研究發現HIF-1α在COPD患者血清中水平顯著高于肺功能正常組，推測HIF-1α水平增加與COPD患者肺功能障礙有關。李芳等[6]研究發現，HIF-1α在COPD患者外周血單個核細胞中水平明升高。戈艷蕾等[14]研究發現HIF-1α在COPD患者血清中水平明顯高于對照組。本研究發現HIF-1α在穩定期COPD組和急性加重期COPD組患者血清中水平顯著高于對照組，提示HIF-1α可能在COPD疾病發展中有一定作用。與穩定期COPD組比較，HIF-1α在急性加重期COPD組患者血清中顯著升高，提示HIF-1α可能與COPD病情嚴重密切相關。進一步Pearson相關分析顯示，HIF-1α與FVC、FEV1/FVC、MMEF、PEF和PaO2呈負相關性，與PaCO2呈正相關性。提示血清HIF-1α水平變化可能對COPD患者呼吸功能有重要影響。

研究發現，mir-210與肺炎、哮喘、COPD等各種呼吸系統疾病密切相關[15]。Li等[16]研究發現mir-210在肺癌組患者血漿表達水平顯著低于COPD組，猜想mir-210可能與COPD發生發展相關。Wang等[17]研究發現mir-210在老年COPD患者外周血中表達水平顯著低于健康對照組。本研究發現mir-210表達水平在穩定期COPD組和急性加重期COPD組患者血清中顯著降低，提示mir-210可能在COPD疾病發生具有一定作用。急性加重期COPD組患者血清中mir-210表達水平顯著低于穩定期COPD組，提示mir-210表達水平變化可能與疾病嚴重程度相關。本研究還發現mir-210與FVC、FEV1/FVC、MMEF、PEF和PaO2存在正相關性，與PaCO2存在負相關性，提示COPD患者mir-210表達水平變化可能一定程度上也影響患者呼吸功能。章輝等[18]研究發現在低氧條件下，大鼠氣道平滑肌細胞miR-199-5p表達減少，HIF-1α水平增加，推測miR-199-5p可能能抑制低氧條件下HIF-1α水平增加。本文研究發現COPD患者血清mir-210表達水平與HIF-1α存在負相關性，提示mir-210與HIF-1α可能存在相互作用關系，共同參與COPD疾病發生發展。

綜上所述，HIF-1α在COPD患者血清中呈高表達，mir-210呈低表達，二者呈負相關，均與肺功能指標及血氣指標水平相關，可能與COPD疾病發生發展密切相關。本研究尚待繼續探討mir-210與HIF-1α如何相互作用影響COPD疾病。