慢性心力衰竭患者血漿外泌體miR-214-3p和miR-184的表達及意義

曹春

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)，是心血管疾病系統的終末階段[1]。心血管系統疾病致死率很高，所以目前臨床上急需新的、有較好價值的生物診斷指標。外泌體miRNA有高度的生物學穩定性，儲存在-70℃ 1個月，其基因表達譜仍然具有研究價值[2]，且外泌體miRNA具有耐酸性質。有研究顯示，外泌體中miR-194、miR-192在急性心肌梗死后期、心力衰竭早期表達水平明顯上升，外泌體miRNA與心力衰竭早期左心室的舒張功能相關，所以外泌體miRNA可能是心力衰竭早期的診斷標志物[3]。另有報道miR-184在心血管疾病、結腸癌疾病、肺癌等疾病中都具有抑制作用[4]。然而，外泌體miR-214-3p、miR-184在心力衰竭中研究報道較少。本研究擬探討miR-214-3p、miR-184在CHT患者血漿外泌體表達情況，并分析其與CHT的關系，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016至2018年在本院就診的CHF患者106例(心衰組)，其中男57例，女49例；年齡54～89歲，平均年齡(70.90±11.90)歲；另外選取本院健康體檢者127例(對照組)，其中男62例，女65例；年齡53～87歲，平均年齡(68.70±12.80)歲。本研究通過倫理委員會批準，受試者知情同意并簽署臨床研究協議書，符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 心力衰竭納入標準：①參照《中國心力衰竭診斷和治療指南2014》，診斷明確的慢性心力衰竭。②符合紐約心臟協會心功能分級(NYHA心功能分級)，Ⅰ級：體力活動不受限制；Ⅱ級：體力活動輕度受限；Ⅲ級：體力活動明顯受限；Ⅳ級：不能從事任何體力活動。

1.2.2 排除標準：伴有肺源性心臟病、風濕性心臟病、嚴重內分泌疾病、嚴重肝腎功能異常、嚴重的感染性疾病、妊娠、血液透析、惡性疾病者。

1.3 儀器與試劑 外泌體抽提試劑盒，美國Invitrogen公司；miRcute miR親和柱，北京天根生化有限公司；引物，上海生工生物公司；反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒，日本TaKaRa公司；低速離心機，美國賽默飛世爾公司；-80℃超低溫冰箱，上海生工生物公司；熒光定量PCR儀，美國Bio-Rad公司；貝克曼生化分析儀，美國貝克曼庫爾特公司；iu22心臟彩色多普勒超聲，荷蘭飛利浦電子集團。

1.4 研究方法

1.4.1 樣品采集與保存:入院治療CHF患者及健康體檢者晨起后，空腹抽靜脈血5 ml，裝于EDTA-K2抗凝管中，置于4℃、3000×g，半徑10 cm，離心5 min，分離血漿。將樣品備份保存于-80℃超低溫冰箱中。

1.4.2 熒光定量PCR檢測血漿外泌體miR-214-3p、miR-184的表達:按照外泌體提取試劑盒指示說明，提取樣本血漿中外泌體。使用天根公司miRcute miR親和柱提取和純化外泌體小RNA。將純化好的樣品miRNA裝于200 μl無RNA酶EP管中，用15 μl無RNA酶ddH2O溶解。備份保存于-80℃超低溫冰箱中。分光光度計檢測產物的OD260/OD280，取OD260/OD280值介于1.9～2.1進行反轉錄。miR-214-3p、miR-184及內參基因U6引物序列由上海生工合成。將得到的cDNA反應液作為模板，以U6作為內參進行熒光定量PCR擴增反應。qRT-PCR反應體系20 μl：2×UltraSYBR Mixture 10.0 μl，Template cDNA(50 ng/μl)2.0 μl，Forward Primer 1.0 μl，Reverse Primer 1.0 μl，ddH2O 6.0 μl。反應條件：95℃，3 min；95℃，25 s；62℃，20 s；72℃，15 s；35個循環。對miR-214-3p、miR-184相對表達量用2-ΔΔCT法計算。見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4.3 相關臨床指標檢測:①超聲心動圖:檢測所有受試者，進行心臟超聲檢測，檢測項目包括左心室舒張末期內徑(LVEDD)、左心室短軸縮短率(FS)、左心室射血分數(LVEF)等。②血漿腦鈉肽(BNP)水平:所有受試者清晨空腹抽靜脈血6 ml，室溫靜置35 min，于4℃、3000×g離心10 min，分離血清，使用貝克曼生化分析儀測定血漿BNP水平。

2 結果

2.1 2組一般資料比較 與對照組比較，心衰組年齡、性別比、糖尿病、高血壓比例差異無統計學意義(P>0.05)，心衰組FS、LVEF水平低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，心衰組BNP、LVEDD、顯著高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組臨床資料比較

2.2 2組血漿外泌體中miR-214-3p、miR-184表達 與對照組比較，心衰組患者血漿外泌體中miR-184表達水平顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)，miR-214-3p表達水平顯著上升，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 CHF患者血漿外泌體中miR-214-3p、miR-184表達水平

2.3 不同心功能分級患者血漿外泌體miR-214-3p、miR-184表達水平比較 與對照組比較，Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級不同心功能分級患者血漿外泌體miR-214-3p表達水平依次升高，miR-184表達水平依次降低，兩兩比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 不同心功能分級患者miR-214-3p、miR-184表達水平

2.4 不同心功能分級患者BNP、LVEDD、FS、LVEF水平比較 與對照組比較，Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級不同心功能分級患者LVEDD、血漿BNP水平依次升高，兩兩比較差異有統計學意義(P<0.05)，FS、LVEF水平依次降低(P<0.05)。見表5。

表5 4組患者BNP、LVEDD、FS、LVEF水平比較

2.5 Pearson相關分析 Pearson相關分析顯示，CHF組血漿外泌體miR-214-3p表達水平與BNP、LVEDD呈正相關(P<0.05)，與LVEF呈負相關(P<0.05)；miR-184表達水平與BNP、LVEDD呈負相關(P<0.05)，與LVEF呈正相關(P<0.05)。見表6。

表6 血漿外泌體中miR-214-3p、miR-184水平與臨床指標相關性分析

3 討論

CHF是各種心血管疾病發展的終末階段。研究表明，miRNA在糖尿病性心肌病的發生及脂肪分化中均具有重要作用[5,6],因此研究miRNA表達水平對臨床CHF早期診斷意義重大。

BNP與心功能有密切關系，邸玉青[7]證實BNP在心力衰竭患者血漿中濃度隨心功能等級遞增(NYHA心功能分級Ⅰ～Ⅳ)逐漸增加。本研究發現，BNP在CHF血漿中水平顯著升高。BNP的分泌主要與左心室壁張力有關，張惠敏[8]發現心力衰竭患者LVEF的降低程度與BNP分泌顯著相關，外周血血漿BNP水平可反映LVEF損害程度。王小燕等[9]發現在NYHA Ⅲ、Ⅳ級CHF患者LVEDD水平顯著高于NYHA Ⅰ、Ⅱ級患者，FS水平顯著低于Ⅰ、Ⅱ級患者。本研究發現Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級不同心功能分級CHF患者LVEF、FS水平呈下降趨勢，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級不同心功能分級CHF患者LVEDD水平呈遞增趨勢，提示CHF患者心室均存在不同程度損傷。

Zhou等[10]研究發現miR-184通過與lncRNA UCA1競爭性結合靶位點，促進心臟肥大疾病發生，且miR-184表達水平與心臟肥大患者心肌細胞中的lncRNA UCA1表達呈負相關。Huang等[11]利用大鼠研究實驗發現miR-184在紫紺型先天性心臟病缺氧性心肌細胞中表達水平下調，因此可能減少心肌細胞的增殖和誘導心肌細胞的凋亡。在臨床上，Gurha等[12]研究發現miR-184在幼兒胚胎心臟中表達最高，在成人心肌細胞中最低。本研究發現，miR-184在CHF組血漿外泌體中表達水平顯著下降，提示miR-184可能參與CHF疾病發生。miR-184表達水平隨CHFⅡ級、Ⅲ級、Ⅳ級不同心功能分級增加而減少，進一步相關性分析顯示，miR-184表達水平與BNP、LVEDD存在負相關性，與LVEF存在正相關性，提示miR-184可能與CHF患者心功能損傷程度有關。

有研究顯示腫瘤細胞的發育、分化及乳腺癌、胰腺癌等疾病與miRNA-214表達異常有密切關系，可作為腫瘤診斷的分子標志物[13]。Onrat等[14]發現，miR-214-3p在缺血性擴張型心肌病和特發性擴張型心肌病血清中表達水平呈升高趨勢。Yan等[15]發現miR-214-3p在心臟衰竭患者成人心臟心肌細胞中表達水平較胎兒時期低。本研究顯示miR-214-3p在心衰組血漿外泌體中表達水平顯著上升，且miR-214-3p表達水平隨CHFⅡ、Ⅲ、Ⅳ級不同心功能分級增加而增加。相關性分析顯示，miR-214-3p表達水平與BNP、LVEDD呈正相關，與LVEF呈負相關，提示miR-214-3p與CHF患者心功能有關，可能參與調節CHF發生發展。

綜上所述，miR-184在CHF患者血漿外泌體呈低表達，miR-214-3p呈高表達，與患者心功能有關，可能參與CHF疾病發生發展。本研究超聲心動圖檢查結果會受到儀器的敏感度、檢查者的技術等影響，患者心功能等級劃分是由臨床醫師執行，二者均存在一定的不足，miR-184、miR-214-3p成為生物學標志物尚需更多臨床研究。