體外沉默異戊二烯基半胱氨酸羧基甲基轉移酶對人舌鱗狀細胞癌細胞增殖和凋亡的影響

王少如 孫偉 周男 趙開 李文健 遲增鵬 王瑩王奇民 童磊 何宗軒 韓紅鈺 陳正崗

1.青島大學附屬青島市市立醫院口腔醫學中心，青島266071；2.大連醫科大學口腔醫學院，大連116044；3.濰坊醫學院口腔醫學院，濰坊261021；4.青島大學口腔醫學院，青島266003；5.濟南市第四人民醫院口腔科，濟南250031；6.青島大學附屬醫院口腔頜面外科，青島266005

口腔癌是一種常見的頭頸部惡性腫瘤，90%為口腔鱗狀細胞癌。其中舌鱗狀細胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）約占口腔鱗狀細胞癌的30%，是口腔癌中最常見的惡性腫瘤之一[1-2]，具有發病率高、發展快、轉移早、致死率高等特點，雖然醫療技術在不斷改進，但患者5年生存率仍在50%～60%[3]。近年來流行病學調查發現舌癌發病率逐漸增加，且發病年齡呈年輕化趨勢[4-5]，故尋找新的治療方案至關重要。

Rho GTPases 屬于小G 蛋白的Ras 超家族中的一個獨立家族，具有三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）酶活性，在胞質中與二磷酸鳥苷（guanosine diphosphate，GDP）結合處于非活性狀態，與GTP 結合后處于活性狀態并與胞膜穩定結合。其作為信號轉換器或分子開關可與上游激活物和下游靶點相互作用，通過參與細胞黏附、細胞骨架重建、細胞增殖和凋亡、細胞運動等行為發揮生物學功能[6]。因其羧基末端均含有一個-CAAX 終端盒，缺乏傳統膜相關蛋白所具有的跨膜或疏水結構域，需經過一系列翻譯后修飾才能發揮蛋白膜靶向性及生物學功能[7]。異戊二烯基半胱氨酸羧基甲基轉移酶（isoprenylcysteine carboxyl methyltransferase，Icmt）作為Rho 蛋白翻譯后修飾的第三步修飾酶，催化蛋白末端-CAAX 羧甲基化，在增強Rho 蛋白的膜親和力及其生物學活性中發揮著重要作用[8]。研究發現Rho 家族成員尤其是RhoA在多種腫瘤組織中高表達，如口腔癌[9]、乳腺癌[10]、肺癌[11]、結腸癌[12]、胃癌[13]、肝癌[14]等，并與腫瘤的惡性程度、發生發展、侵襲轉移和臨床預后有關，在舌癌中也已得到證實[15-17]。近年來通過基因或藥物靶向抑制Icmt，阻斷RhoA 甲基化可對腫瘤產生一定的影響，但目前有關Icmt對TSCC的研究報道少見。

本研究利用RNA 干擾（RNA interference，RNAi）技術，通過體外設計合成人Icmt 基因的小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）序列，并經脂質體瞬時轉染技術轉染至TSCC 細胞系CAL-27 和SCC-4，觀察siRNA 對Icmt 及RhoA 的作用，探討其對TSCC細胞增殖和凋亡的影響，為Icmt作為靶點在TSCC治療中的應用提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

人TSCC 細胞系CAL-27 購于中南大學高等研究中心，SCC-4由山東大學口腔醫學院饋贈。高糖型DMEM 基礎培養基、胎牛血清（BI 公司，以色列），青霉素/鏈霉素、胰蛋白酶（Gibco 公司，美國），Icmt-siRNA 合成、轉染試劑（廣州銳博生物科技有限公司），RNA 提取試劑盒、反轉錄試劑盒、TB Green Premix Ex TaTM（TaKaRa 公司，日本），實時熒光定量聚合酶鏈反應（quantitive realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR）引物Icmt、RhoA、磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH）合成（上海生工生物工程有限公司），RIPA裂解液、細胞膜蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒、蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物、細胞周期與凋亡檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），兔抗人多克隆抗體Icmt、p21、細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）（Proteintech公司，美國），RhoA（Abcam 公司，美國），細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、磷酸化的細胞外調節蛋白激酶（phospho-extracellular regulated protein kinases，p-ERK）（CST 公司，美國），細胞增殖活性檢測試劑盒（cell counting kit-8，CCK-8）（MCE 公司，美國），Annexin V-APC/碘化丙啶（propidium staining，PI）熒光雙染細胞凋亡檢測試劑盒（武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）。

1.2 細胞培養

CAL-27 和SCC-4 培養均采用含有10%胎牛血清、100 U·mL-1青 霉 素 和100 μg·mL-1鏈 霉 素 的DMEM 高糖培養基，置于37 ℃、5%CO2恒溫孵育箱中分別培養。隔日換液，待細胞鋪滿瓶底80%～90%時，以1∶3 的比例接種至新的培養瓶中傳代培養及后續實驗。

1.3 方法

1.3.1 siRNA 轉染效率測定 分別將處于對數生長期的CAL-27 和SCC-4 細胞以密度為每孔2×105個接種于6 孔板內，待細胞密度達30%～50%時進行轉染。按照說明書用120 μL riboFECTTMCP Buffer稀釋5 μL 20 μmol·L-1熒光基團Cy3 標記的siRNA儲存液（轉染時siRNA 終濃度為50 nmol·L-1），輕吹打混勻以后加入12 μL riboFECTTMCP Reagent，室溫下孵育0～15 min 后，加入到1 863 μL 更新的無雙抗完全培養基中。37 ℃、5%CO2恒溫孵育箱中孵育24 h，于倒置熒光顯微鏡下明確siRNA 的轉染效率。

1.3.2 Icmt siRNA 轉染沉默Icmt 基因 針對人Icmt基因序列設計并合成3條siRNA（表1）和1條陰性對照序列NC-siRNA。轉染前1 d 以每孔2×105個分別將CAL-27和SCC-4細胞接種于不同的6孔板內，待貼壁細胞融合達30%～50%時進行轉染。實驗設計分組包括空白對照組（僅加轉染試劑）、陰性對照組（轉染NC-siRNA）、實驗組（Icmt-siRNA-1組、Icmt-siRNA-2 組、Icmt-siRNA-3 組）。根據分組，按siRNA轉染試劑盒說明書，同上所述制備成不同組別的轉染復合物（轉染時siRNA 終濃度為50 nmol·L-1）。棄6 孔 板 內原 培 養基，PBS 沖 洗3次，每孔加入適量無雙抗完全培養基，將制備好的轉染復合物加入相應6 孔板內（使終末體積均為2 mL），及時混勻以后繼續于孵育箱中培養。在轉染一定時間后進行相應的細胞水平或分子水平的檢測。

表1 針對Icmt基因序列設計3條Icmt-siRNATab 1 Three Icmt-siRNA sequences designed for Icmt gene

1.3.3 qRT-PCR檢測Icmt、RhoA mRNA表達 按上述分組，提取各組轉染24 h 后的細胞總RNA 并用紫外分光光度計檢測每組所提RNA的濃度和純度。應用反轉錄試劑盒，取適量RNA 反轉錄為cDNA，每組取2 μL cDNA 進行qRT-PCR，均設3 個副孔。Icmt 上游引物序列：5’-CGGCATCCTTCTTACGTCGG-3’，下游引物序列：5’-CCACACTGTCAGGGCATAGC-3’；RhoA 上游引物序列：5’-TGTGGCAGATATCGAGGTGGATGG-3’，下游引物序列：5’-GGCCTCAGGCGATCATAATCTTCC-3’；內參GAPDH 上游引物序列：5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游引物序列：5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）反應體系的配置及反應參數等均按TB Green Premix Ex TadTMⅡ試劑盒說明書進行。使用ABI PRISM 7000 實時熒光定量PCR 儀對熒光信號實時監測和數據分析后，根據Ct 值 應 用2-△△Ct公 式 量 化 各 組Icmt、RhoA mRNA 的相對表達水平，并根據3 組實驗組Icmt mRNA 的相對表達量選取沉默效率最高組作為實驗組進行后續研究，實驗重復3次。

1.3.4 蛋白質免疫印跡法（Western blot）檢測目的蛋白及細胞周期相關蛋白表達 采用RIPA 裂解液提取轉染48 h 后各組細胞的蛋白質，細胞膜蛋白與細胞漿蛋白提取試劑盒提取的各組RhoA 膜蛋白，按照二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒操作說明測定蛋白濃度并定量蛋白質。加1/4 總 體積的Loadingbuffer，100 ℃變 性10 min，等量上樣，在10%聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離后，采用濕轉法將蛋白轉至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜中，置5%脫脂奶粉中室溫搖床封閉PVDF 膜1 h。加入一抗（Icmt，1∶1 000；RhoA，1∶5 000；p21，1∶800；Cyclin D1，1∶5 000；ERK，1∶1 000；p-ERK，1∶5 000；GAPDH，1∶5 000），4 ℃孵育過夜。三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水（triethanolamine buffered saline，TBST） 洗膜3 次（每次10 min），置二抗（1∶50 000）孵育夜中，室溫搖床孵育2 h，TBST 洗膜3 次（每次10 min）。加入電化學發光液顯色、曝光，采集圖像。使用Image J 軟件分析灰度值，并以GAPDH 為內參，計算各檢測蛋白與內參的比值。

1.3.5 CCK-8 試劑盒檢測細胞的增殖能力 取對數生長期的CAL-27 和SCC-4 細胞消化離心后，調整細胞密度為每孔（100 μL）2×103個細胞，接種于96 孔板內，待細胞密度達30%時進行轉染（方法同前），每組均設5 個平行副孔。轉染后置于孵育箱內培養不同時間（0、24、48、72 h），按試劑盒說明書操作，每孔加入10 μL CCK-8溶液，于培養箱中避光孵育2 h后，酶標儀檢測波長450 nm的光密度（optical density，OD）值，應用GraphPad Prism 8.2.1 軟件繪制細胞增殖曲線，觀察各組細胞增殖情況。實驗重復3次。

1.3.6 流式細胞儀檢測細胞的周期變化 轉染48 h后，棄原培養基，PBS沖洗3次，消化收集細胞懸液1 000 g 離心5 min，1 mL 冰浴預冷PBS 重懸細胞，再離心。加入1 mL 冰浴預冷70%乙醇輕吹打混勻后4 ℃固定過夜，冰浴預冷PBS 洗滌2 次后，每管樣品加0.5 mL PI 染色，37 ℃避光溫浴30 min后在24 h 之內進行流式細胞儀檢測，結果采用ModFit LT軟件分析。實驗重復3次。

1.3.7 Annexin V-APC/PI 熒光雙染法凋亡試劑盒檢測細胞的凋亡能力 細胞轉染48 h后，分別取各組上清于對應的離心管中待用，加入適量0.25%胰蛋白酶（不含乙二胺四乙酸）消化收集細胞于上述對應離心管中，500 g 離心5 min，棄上清，適量PBS 洗滌1 次后重懸細胞并計數。每組均取5×105個重懸細胞，500 g 離心5 min，PBS 洗滌1 次，加入500 μL 稀釋的1×Annexin V BindingBuffer 工作液重懸細胞。依次加入5 μL Annexin V-APC和5 μL PI 染色液，渦旋混勻，室溫避光孵育20 min 后立即上機檢測，結果采用FlowJo V10 軟件分析。實驗重復3次。

1.4 統計學分析

應用GraphPad Prism 8.2.1 軟件進行作圖統計分析，實驗數據以均數±標準誤表示，2 組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 siRNA轉染效率

熒光組CAL-27 和SCC-4 細胞分別在轉染熒光基團Cy3標記的siRNA 24 h后，于倒置熒光顯微鏡下觀察，對比相同視野在普通光鏡下和熒光顯微鏡下均發現90%以上的細胞都顯示紅色熒光（圖1），表明多數細胞已經轉染siRNA，轉染效率高。

2.2 轉染后各組細胞Icmt、RhoA mRNA的表達

qRT-PCR 結果顯示，轉染siRNA 24 h 后，與空白對照組相比，陰性對照組Icmt mRNA 表達無明顯變化（P＞0.05），各實驗組Icmt mRNA 相對表達量均明顯下降（P＜0.05），而RhoA mRNA 表達無明顯變化（P＞0.05）（圖2）。對各實驗組Icmt mRNA的表達進行比較，Icmt-siRNA-1和Icmt-siRNA-3 組的沉默效率最高，故后續應用這2 組作為實驗組進行研究。

2.3 轉染后各組細胞目的蛋白的表達

Western blot 檢測轉染48 h 后各組細胞蛋白表達量，結果表明，與陰性對照組和空白對照組相比，實驗組Icmt 蛋白表達下降（P＜0.05），RhoA總蛋白表達無明顯區別（P＞0.05），而RhoA 膜蛋白表達顯著降低（P＜0.05）（圖3）。

2.4 轉染后對各組細胞增殖能力的影響

在轉染0、24、48、72 h 后，陰性對照組和空白對照組細胞增殖能力無明顯差異（P＞0.05），而實驗組隨時間變化細胞增殖能力逐漸下降（P＜0.05）（圖4）。

圖1 siRNA轉染效率Fig 1 siRNA transfection efficiency

圖2 轉染Icmt-siRNA后各組細胞Icmt、RhoA mRNA的表達Fig 2 Expression of Icmt and RhoA mRNA after Icmt-siRNA transfection

2.5 轉染后各組細胞的周期變化

流式細胞儀檢測結果表明，轉染48 h 后，實驗組較對照組相比，G1 期細胞比例增加，S 期細胞比例減少，G2 期細胞比例無明顯變化，細胞周期阻滯在G1/S 期，其差異具有統計學意義（P＜0.05）（圖5）。采用Western blot檢測細胞周期相關蛋白，結果顯示Cyclin D1 蛋白表達下降，p21 蛋白表達升高（P＜0.05）（圖6）。

2.6 轉染后各組細胞凋亡能力的變化

在各組細胞轉染48 h 后，利用Annexin VAPC/PI 熒光雙染法于流式細胞儀檢測得出各象限細胞比率，結果顯示，空白對照組、陰性對照組、Icmt-siRNA-1 組、Icmt-siRNA-3 組CAL-27 細胞凋亡率分別為（3.80±0.09）%、（6.01±0.20）%、（15.30±0.45）%、（12.53±0.28）%；SCC-4 細胞凋亡率分別為（1.66±0.12）%、（2.30±0.03）%、（8.60±0.05）%、（6.80±0.11）%。結果均發現實驗組凋亡細胞增加（P＜0.05）（圖7）。

2.7 轉染后各組細胞ERK 信號通路相關蛋白ERK和p-ERK的表達變化

為研究體外沉默Icmt 對CAL-27 及SCC-4 細胞影響的相關機制，采用Western blot 檢驗ERK 信號通路的相關蛋白，結果顯示，ERK 蛋白表達無變化，p-ERK蛋白表達下調（P＜0.05）（圖8）。

圖3 轉染Icmt-siRNA后各組細胞Icmt和RhoA蛋白的表達Fig 3 Expression of Icmt and RhoA protein after Icmt-siRNA transfection

圖4 轉染Icmt-siRNA后對各組細胞增殖能力的影響Fig 4 Effection of Icmt-siRNA transfection oncell proliferation capacity

圖5 轉染Icmt-siRNA后各組細胞周期的變化Fig 5 Cell cycle changes after Icmt-siRNA transfection

圖6 轉染Icmt-siRNA后細胞周期相關蛋白Cyclin D1和p21的表達Fig 6 Expression of Cyclin D1 and p21 protein after Icmt-siRNA transfection

圖7 轉染Icmt-siRNA后細胞凋亡能力的變化Fig 7 Effection of Icmt-siRNA transfection on cell apoptosis

3 討論

Icmt 是相對分子質量為32 000 的蛋白，定位于內質網（endoplasmic reticulum，ER）上，催化小G 蛋白家族成員的-CAAX 末端殘基的甲基化修飾[8]，其對哺乳動物的細胞生長至關重要，同時對許多癌蛋白的穩定和功能的發揮也非常重要[18]，如可促進Rho 蛋白的膜親和力及信號傳遞功能[19]。研究[20-22]表明，Icmt 在多種惡性腫瘤組織中表達上調，如在卵巢癌的檢測樣本中發現Icmt 的表達較正常組織可高達93%，但同時發現并不是所有被測試的樣本中被觀察到上調。在檢測的肝癌樣本中也發現，Icmt 僅在70%的肝癌樣本中表現為高表達狀態。這些結果表明，Icmt 的表達情況可能存在組織差異性問題，但其在惡性腫瘤中多表現為上調。并有大量研究[23-26]證明，Icmt 在腫瘤的惡性轉化、腫瘤的維持、生長增殖和轉移中發揮關鍵作用。因此，降低Icmt 酶活性可能是一種更有效的抗癌靶點，近年來受到了越來越多的關注，但其對TSCC的影響尚未明確。

本研究采用siRNA干擾技術，以CAL-27和SCC-4 細胞為研究對象，體外沉默Icmt 基因，觀察對TSCC的影響。結果顯示有效沉默Icmt基因表達后，各組RhoA mRNA 和總蛋白的相對表達量較對照組雖無明顯差異，但RhoA 膜蛋白相對表達量顯著降低。由此推測，沉默Icmt并不影響RhoA 基因的轉錄和蛋白的翻譯，但可能通過降低RhoA 的甲基化修飾，影響胞質內RhoA 蛋白與細胞膜的穩定結合。只有被修飾后的RhoA 才能正確的定位于細胞膜上，以參與細胞增殖分裂、細胞黏附和遷移、細胞凋亡等[6]。Bergo 等[27]將抑制Icmt 對腫瘤細胞增殖能力的影響歸因于抑制Icmt 酶活性影響了RhoA 羧基末端的甲基化修飾，使其與細胞膜穩定結合的水平降低，進而減弱與下游效應分子的相互作用。此外，研究[18]發現，Icmt催化的甲基化修飾對蛋白質-蛋白質相互作用和蛋白質穩定性也很重要。Manu等[28]研究發現，RhoGEF 只與經過翻譯后修飾的RhoA 相互作用，促進RhoA 由與GDP 結合的非活性狀態轉化為與GTP 結合的活性狀態。由此推測，抑制Icmt 酶活性可能通過降低RhoA的膜結合水平和活性的發揮影響TSCC 的發展。

圖8 轉染Icmt-siRNA后ERK和p-ERK的表達Fig 8 Expression of ERK and p-ERK protein after Icmt-siRNA transfection

大量研究[22,27,29]表明，降低Icmt 酶活性可導致細胞周期阻滯，抑制腫瘤細胞生長而誘導腫瘤細胞死亡及影響腫瘤細胞對化療的敏感性。本研究結果顯示實驗組細胞轉染Icmt-siRNA 后，明顯降低了RhoA 與細胞膜的結合水平，細胞周期阻滯在G1/S期，增殖能力降低而凋亡水平增加。RhoA 作為信號轉換器或分子開關可與上游激活物和下游靶點相互作用。有研究[30-32]證實，RhoA 可直接刺激Cyclin D1啟動子并引起Cyclin D1蛋白的上調及調節細胞周期蛋白依賴性激酶抑制物（cyclin dependent kinase inhibitors，CKIs）的活性，促進G1期的進展和DNA 合成；亦可以通過介導的絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinas，MAPK）/ERK 信號途徑，調節細胞周期蛋白和CKIs 的水平。RhoA 處于非活性狀態時可增加ERK 磷酸化水平，導致p21 表達增加，抑制增殖[31,33]。通過體外沉默RhoA基因的表達，可使Cyclin D1 在G1 期的表達受到明顯的抑制，而p21、p27 表達水平顯著增高，致舌癌細胞周期停滯，細胞增殖能力降低[17]。在本實驗體外沉默Icmt 后，檢測到實驗組細胞周期相關蛋白Cyclin D1 表達下調，p21 表達上調，同時測得ERK 磷酸化水平下降。由此推測，沉默Icmt 基因的表達亦可負性調控周期相關蛋白Cyclin D1、p-ERK 和上調p21 蛋白的表達，使細胞周期停滯在G1 期而不能進入S期，最終使細胞增殖受到明顯的抑制，而細胞凋亡水平相應增高。

綜上所述，利用siRNA干擾技術可有效抑制人舌鱗癌細胞Icmt基因的表達，影響RhoA 蛋白羧基末端甲基化修飾，降低穩定的膜靶向定位及其活性的發揮，并通過調控Cyclin D1、p21和p-ERK的表達，使細胞周期阻滯在G1/S 期，進而抑制舌鱗癌CAL-27 和SCC-4 細胞增殖而誘導細胞凋亡。本研究為Icmt作為TSCC的基因治療的新靶點提供了一定的實驗依據，但Icmt 對Rho 家族蛋白的具體作用機制尚需進一步研究。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。