枇杷酵素自然發酵過程中有機酸及其抗氧化活性的研究

付龍威，湯曉娟，林祥娜，張艷珍，劉云國*

（1.新疆大學生命科學與技術學院，新疆 烏魯木齊 830046；2.臨沂大學生命科學學院，山東 臨沂 276000）

枇杷[Eriobotrya japonica（Thunb.）Lindl]屬薔薇科植物，其花、果、葉均可入藥。成熟枇杷鮮果不僅酸甜可口、營養豐富，具有止咳潤肺、消炎鎮痛、延緩衰老等生理功效[1]；還具有抗動脈硬化、抗血栓、抗胃潰瘍、抗菌、抗突變的生物活性及皮膚保健和美容等功效[2]，是進行果蔬深加工的良好原料。枇杷是一種季節性水果，應季的時候產量較大，且不耐儲存和運輸，極易變質[3]。因此解決枇杷短期量大的問題備受關注。

目前枇杷果實除鮮食外，其加工產品仍然以果汁、罐頭、果醬以及干制為主，少量的枇杷酒及醋飲料[4-5]，枇杷的深加工及其綜合利用還有待加強，目前尚未見枇杷酵素的報道。食用植物酵素（edible plant enzyme）是以新鮮蔬菜、水果、藥食兩用本草類為原料，經多種有益菌通過較長時間發酵而生產的功能性發酵產品。研究表明，酵素可有效地清除體內過剩的自由基，在預防和治療因自由基誘發的疾病和抗衰老方面具有廣闊的應用前景[6-7]。目前酵素品類繁多，但品質差別大，且相關科學研究支撐不足，亟需深入開展酵素發酵過程功能組分和功效研究，進而用標準化手段規范傳統工藝，保證酵素品質。

本研究以枇杷酵素為研究對象，通過測定枇杷自然發酵過程中pH值、可滴定酸、有機酸、總酚含量變化來分析枇杷發酵過程中活性成分的變化；以DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力、羥基自由基清除能力和超氧陰離子自由基清除能力為抗氧化性指標，評價枇杷酵素的抗氧化活性，為枇杷酵素的綜合開發提供相關理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枇杷：采自莆田地區；白砂糖（食品級）：上海怡神保健食品有限公司；標準品沒食子酸：上海源葉生物科技有限公司；乳酸、乙酸、無水酒精、無水亞硫酸鈉、氫氧化鈉、水楊酸鈉、硫酸亞鐵、焦性沒食子酸、過硫酸鉀、氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀（均為分析純）：天津凱通化學試劑有限公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；鄰苯三酚，2，2′-聯氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、1，1-二苯基-2-苦苯肼（DPPH）（均為分析純）：北京謹明生物科技有限公司；福林酚（10%）溶液：北京索萊寶生物科技有限公司；濃鹽酸、濃硫酸、過氧化氫（均為分析純）：煙臺遠東精細化工有限公司。

1.2 儀器與設備

1200高效液相色譜儀：美國Agilent公司；WT-B千分之一分析天平：杭州萬特衡器有限公司；SHZ-S（Ⅲ）循環水式多用真空泵：上海力辰邦西儀器科技有限公司；BEST超純水機：上海芷昂儀器有限公司；DZF-6094真空干燥箱：上海一恒科學儀器有限公司；Mikro-220R離心機：德國Hettich科學儀器公司；752紫外分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；DW-86L626海爾超低溫冰箱：青島海爾股份有限公司；Eppendorf移液槍：德國艾本德股份公司；PHS-3C雷磁pH計：上海雷磁儀器廠；HWS-24型電熱恒溫水浴鍋：上海資一儀器設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 枇杷酵素的制備

無菌水清洗枇杷2遍～3遍，于超凈臺晾干，切片、去除核，枇杷∶糖（1∶1，質量比），加入無菌水，25℃左右自然發酵，pH值在3～4之間發酵結束。定期取樣，將樣品離心后的上清液保存于-80℃超低溫冰箱中待測。

1.3.2 pH值和可滴定酸的測定

使用精密pH計測定酵素樣品的pH值。

可滴定酸含量的測定方法參考文獻[8]，結果以乳酸質量濃度（g/100 mL）計。

1.3.3 酵素中有機酸含量的測定

待測樣品用去離子水稀釋5倍，用0.22 μm微孔濾膜過濾，利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）測定酵素中的有機酸含量。色譜條件：色譜柱為Aminex@HPX-87H Exclusion Column柱（300 mm×7.8 mm），流動相為0.275%（體積比）的濃硫酸溶液，流速0.4 mL/min，柱溫40℃，進樣量10 μL，檢測波長210 nm。

1.3.4 總酚含量的測定

總酚含量的測定方法參考文獻[9]。

1.3.5 DPPH自由基清除能力的測定

DPPH自由基清除能力的測定方法參考文獻[10]。

1.3.6 ABTS+自由基清除能力的測定

ABTS+自由基清除能力的測定方法參考文獻[11]。

1.3.7 羥基自由基清除能力的測定

羥基自由基清除能力的測定方法參考文獻[12]。

1.3.8 超氧陰離子自由基清除能力的測定

超氧陰離子自由基清除能力的測定方法參考文獻[13]。

1.3.9 綜合評價指標分析

綜合評價指標分析的測定方法參考文獻[8]。

1.4 數據處理

每組試驗均重復3次，采用origin 9.1進行繪圖，結果以平均值±標準差表示，SPSS 25軟件進行單因素方差分析、相關性分析和主成分分析，當P＜0.05表示在統計學上具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 枇杷酵素發酵過程中pH值與可滴定酸的變化

枇杷發酵過程中pH值和可滴定酸含量的變化如圖1所示。

圖1 發酵過程中pH值和可滴定酸含量的變化Fig.1 Changes in pH value and total titratable acidity during the enzyme fermentation

由圖1可知，pH值和可滴定酸含量在發酵過程中呈現相反的變化趨勢。pH值在50 d內由（4.920±0.130）迅速下降至（3.37±0.017）（P＜0.05），后緩慢上升直至穩定于3.5左右。發酵過程中，可滴定酸在50 d達到最大值，由（0.048±0.026）g/100 mL 上升至（0.315±0.022）g/100 mL（P＜0.05），50 d 后有所下降并保持平穩（P＞0.05）。發酵前期可滴定酸含量的快速上升是由于自然發酵過程微生物代謝產生的醋酸、乳酸等多種有機酸所致[14]。發酵50 d后可滴定酸含量下降可能是因為酵母菌等微生物降解部分有機酸，導致乳酸、乙酸含量下降[15]。

2.2 酵素發酵過程中有機酸含量的變化

自然發酵酵素中酵母菌、醋酸菌和乳酸菌是最常見的微生物[16]。有機酸標準曲線見表1。枇杷酵素中乳酸和乙酸含量的變化如圖2。

表1 有機酸標準曲線Table 1 Standard curves of organic acids

圖2 發酵過程中乳酸和乙酸含量的變化Fig.2 Changes in lactic acid and acetic acid contents during the enzyme fermentation

發酵過程中乳酸和乙酸含量呈先上升后下降的趨勢。乳酸在第5天沒有檢測出，10 d～20 d由（0.33±0.02）mg/mL 增長到（1.82±0.68）mg/mL，增幅達451.52%（P＜0.05），20 d以后緩慢增加，在第40天達到最大值（2.09±0.05）mg/mL。乙酸在前20 d增加且第20天達到最大值（2.67±0.65）mg/mL（P＜0.05），之后緩慢下降至（1.48±0.03）mg/mL。枇杷酵素中的有機酸除植物材料中固有有機酸溶出外，主要由發酵過程中大量繁殖的產酸微生物代謝生成，而發酵后期有機酸減少可能一方面由于糖類物質消耗，微生物利用有機酸作為碳源，或較低pH值抑制部分微生物生長，導致有機酸含量略有下降[17]，另一方面可能因為在微生物的作用下消耗有機酸和單糖產生芳香味的酯類有關。20 d～40 d之間，乙酸緩慢減少，乳酸緩慢增加可能因為乳酸菌通過糖代謝生成乳酸，在厭氧條件下還可將乳酸氧化轉化為乙酸[18]。

2.3 酵素發酵過程中總酚含量的變化

酚類物質具有較強的抗氧化活性。以沒食子酸為標品，標準曲線為Y=0.001 3x-0.026 5，R2=0.999 6。酵素發酵過程中總酚含量變化如圖3所示。

發酵前15 d，總酚含量緩慢上升，可能與發酵前期枇杷在高滲透壓的環境中多酚類物質溶出有關。發酵20 d～30 d總酚含量快速上升（P＜0.05），于 30 d達到最大值（2.08±0.06）mg/mL，這可能與隨著發酵的進行，在微生物作用下，單體酚類物質的合成所致[19]。30 d后總酚含量降低（P＜0.05），可能是由于在發酵過程中多酚氧化酶被活化，促進多酚發生氧化生成褐色物質[20-21]，顏色加深；小分子的酚類物質被微生物降解[22]。

圖3 發酵過程中總酚含量變化Fig.3 Changes in total phenolic content during the enzyme fermentation

2.4 酵素發酵過程中DPPH自由基清除率的變化

DPPH是一種很穩定的自由基，被廣泛用于判斷抗氧化劑的清除自由基能力[23]。枇杷酵素發酵過程中DPPH自由基清除率的變化如圖4所示。

圖4 發酵過程中DPPH自由基清除能力變化Fig.4 Changes in DPPH free radical scavenging ability during the enzyme fermentation

發酵過程中DPPH自由基清除率呈先上升后下降的趨勢。枇杷酵素的DPPH自由基清除率在5 d～20 d之間由（32.88±2.08）%迅速上升至（87.45±1.20）%（P＜0.05），增幅達到165.97%，20 d～40 d之間變化幅度較小（P＞0.05），并于發酵 30 d時達到最高的（87.54±1.2）%，40d以后清除能力下降。研究表明隨著時間延長DPPH自由基清除率呈快速上升后緩慢下降的趨勢[24]。

2.5 酵素發酵過程中ABTS+自由基清除率的變化

枇杷酵素發酵過程中ABTS+自由基清除率的變化如圖5所示。

發酵過程中ABTS+自由基清除率呈迅速上升后下降的趨勢。發酵前25 d，ABTS+自由基清除率從（45.00±0.48）%快速上升至（91.93±0.65）%（P＜0.05），增幅達到104.29%。隨后清除率下降，并于第60天降到（57.99±4.81）%（P＜0.05），隨后又上升。本研究結果與百合酵素清除ABTS+自由基的變化相似[25]。賈仕杰等[26]研究表明酚類物質與ABTS+自由基的清除能力具有顯著的正相關性。

圖5 發酵過程中ABTS+自由基清除能力變化Fig.5 Changes in ABTS+free radical scavenging ability during the enzyme fermentation

2.6 酵素發酵過程中羥自由基清除率的變化

羥自由基是氧自由基中最為活潑的自由基，過量的羥自由基會引起生物分子的嚴重損傷。枇杷酵素發酵過程中羥自由基清除率的變化如圖6所示。

圖6 發酵過程中羥自由基清除能力變化Fig.6 Changes in hydroxyl free radical scavenging ability during the enzyme fermentation

發酵過程中羥自由基清除率呈先上升后下降并趨于穩定的趨勢。發酵前40 d，羥自由基清除率從（17.17±0.48）%快速上升至（52.09±0.65）%（P＜0.05），增幅達203.38%，隨后清除率下降至（35.96±0.2）%（P＜0.05）。羥基自由基清除能力的提高可能是由于酵素中多種有機酸綜合作用的結果[26]；也有研究表明酵母壁上的多糖具有一定的羥基自由基清除能力[27]；酚類物質具有較強的羥自由基的清除能力[28]。

2.7 酵素發酵過程中超氧陰離子自由基清除率的變化

超氧陰離子自由基在活性氧物質的形成中起重要作用，主要損害細胞膜[29]。枇杷酵素發酵過程中超氧陰離子自由基清除率的變化如圖7所示。

發酵過程中超氧陰離子自由基清除率呈先上升后下降的趨勢。發酵前 50 d，由（12.90±0.10）%上升至最高（49.7±0.65）%（P＜0.05），增幅達 285.27%，隨后清除率下降。酚類物質具有清除超氧陰離子自由基能力[29]，超氧陰離子自由基清除能力與酚類物質變化趨勢一致，與蔣增良等[30]研究的葡萄酵素自然發酵過程中對超氧陰離子自由基的清除能力的趨勢相似。

2.8 相關性分析

根據Pearson相關分析結果見表2。

枇杷酵素發酵過程中4種體外抗氧化性指標均與總酚含量呈顯著正相關（P＜0.05），其中與DPPH自由基清除能力、ABTS+自由基清除能力和超氧陰離子自由基清除能力呈極顯著正相關（P＜0.01）；乳酸與4種體外抗氧化性呈極顯著關系（P＜0.01），乙酸與DPPH自由基清除能力和ABTS+自由基清除能力呈極顯著正相關（P＜0.01）。說明酵素中的酚類物質和有機酸具有一定的抗氧化性作用。

圖7 發酵過程中超氧陰離子自由基清除能力變化Fig.7 Changes in superoxide anion free radical scavenging ability during the enzyme fermentation

表2 枇杷酵素各參數相關分析Table 2 Correlation analysis of various parameters loquat enzyme

表3 主成分的特征值、貢獻率和累積貢獻率Table 3 The eigenvalue，contribution rate and the cumulative contribution rate of principal components

2.9 主成分分析

為了進一步明確枇杷酵素中各變量之間的相互關系，通過主成分分析對各變量進行降維處理。枇杷酵素主成分的特征值、貢獻率和累積貢獻率見表3。旋轉載荷見表4。

以特征值1.0為納入標準，優化出2個主成分。枇杷酵素的第 1主成分（principal component 1，PC1）貢獻率為63.694%，第2主成分（PC2）貢獻率為23.125%，前2個主成分的累積貢獻率為86.819%，符合主成分分析的要求。PC1反映了pH值、可滴定酸、總酚、乳酸、羥基自由基清除率和超氧自由基清除率的變異信息，PC2反映了乙酸、ABTS+自由基清除率和DPPH自由基清除率的變異信息。通過主成分分析對原先的9種變量指標進行處理后獲得F1、F2兩個新變量，通過公式計算綜合評價指標（comprehensive evaluation indexes，CEI），CEI=（5.732F1+2.081F2）/（5.732+2.081）。

表4 旋轉載荷Table 4 Rotation component matrix

不同時間枇杷酵素的CEI值如圖8。

圖8 枇杷酵素發酵過程中綜合評價指標圖Fig.8 Comprehensive evaluation index of loquat enzyme during fermentation process

發酵第5天時CEI值最低為-1.774，發酵第40天時CEI值最高為0.909。發酵前25 d，CEI值快速上升；發酵25 d～40 d，CEI值較為穩定；發酵40 d以后，CEI值逐漸下降。因此可判斷枇杷酵素的發酵終點為40 d。

3 結論

本文采用不同的自由基體系和Pearson相關分析對枇杷酵素體外抗氧化活性進行了較為全面的研究。從試驗結果可以看出，枇杷酵素對ABTS+自由基和DPPH自由基具有很強的清除作用，并對羥自由基和超氧陰離子自由基也有一定的清除作用，這表明枇杷酵素能夠清除體內多余自由基，具有較好的抗氧化能力。枇杷酵素中富含的乳酸、乙酸和多酚類化合物等活性成分，具有良好的抗氧化活性。綜合考慮時間成本與CEI值，發酵至40 d時CEI值達到最大，因此確定枇杷酵素的發酵終點為40 d。