蘆柑葉總黃酮的提取工藝優化及其抗氧化活性研究

陳建福，彭敏

（1.漳州職業技術學院食品工程學院，福建 漳州 363000；2.湖北工業大學生物工程與食品學院，湖北 武漢 430068）

蘆柑（Citrus reticulata Blanco cv.Ponkan），又名柑果、真柑、乳柑等，為蕓香科柑橘屬植物[1]。蘆柑是福建省的一大名優特產，其汁量豐富、色澤橙黃、風味濃郁，含有豐富的維生素等天然有效成分，深受人們的喜愛[2]。然而人們對蘆柑的利用還主要停留在果肉、果皮和果核上，對于蘆柑采摘后剩下的枝葉利用較少，而實際上蘆柑葉中含有黃酮、多酚、精油等多種天然有效成分[3-4]，其中黃酮是存在于植物的葉、莖、根、花、果中的一類次生代謝物，具有抗衰老、抗病菌、降血脂和抗氧化等多種生理活性功能，已廣泛應用于材料、醫藥、食品和化妝品等相關領域中[5-6]。超聲波輔助提取是利用超聲波的空化作用以促進植物有效成分從植物顆粒中溶出的一種新型提取方法，宋怡偉等[7]采用響應面法對超聲波輔助乙醇提取香椿葉中總黃酮的工藝進行優化，并考察了總黃酮的抑菌作用，結果表明最佳的提取工藝為液料比41∶1（mL/mg）、超聲時間36 min、乙醇濃度65%，所提取的總黃酮對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最明顯，且該方法具有能耗低、不會破壞生物活性、操作簡便、無毒副作用等優點[8]。

為進一步提高蘆柑葉資源的利用率，本研究以蘆柑葉為原料，利用超聲波輔助法對蘆柑葉中總黃酮進行提取，并利用響應面法對提取工藝進行優化，并通過蘆柑葉總黃酮對·OH和DPPH·的清除作用來評價其抗氧化活性，以期為蘆柑葉資源的利用與開發提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

蘆柑葉：采摘于福建省南靖縣金山鎮上麻村。將采摘的蘆柑葉用清水清洗，去除泥沙并晾干，置于50℃干燥箱中烘干，粉碎后過80目篩，備用；乙醇（食品級）：河南鑫河陽酒精有限公司。

紫外可見分光光度計（UV-1100型）：上海美譜達儀器有限公司；高頻數控超聲波清洗器（KQ-100TDE）：昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線繪制

將蘆丁用75%的乙醇溶解，配制成0.25 mg/mL的蘆丁標準液。在10 mL的具塞玻璃比色管中，分別加入一定體積的蘆丁標準液，再分別加入5%的亞硝酸鈉溶液和10%的硝酸鋁溶液各0.3 mL，搖勻，靜置6 min后，分別加入4%的氫氧化鈉溶液2 mL，定容，靜置反應15 min，在510 nm下測定吸光度（A），以75%的乙醇做空白對照。以OD510為縱坐標，對照品的濃度（mg/L）為橫坐標，繪制標準曲線Y=0.011 28X-0.016 58，R2=0.999 2。

1.2.2 蘆柑葉總黃酮的含量測定

在100 mL的圓底燒瓶中加入稱好的蘆柑葉粉m（g）和乙醇溶液，并在設定的溫度下進行超聲輔助提取。提取結束后，過濾，定容到體積V（L），按照1.2.1方法，測定提取液的吸光度，計算提取液中總黃酮的質量濃度C（mg/L），通過下式得蘆柑葉總黃酮的提取率。

1.2.3 單因素試驗設計

在固定液料比35∶1（mL/g）、乙醇濃度75%、超聲溫度70℃和超聲時間25 min的條件下，每個因素設5個水平：液料比25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1（mL/g）、乙醇濃度65%、70%、75%、80%、85%，超聲溫度 60、65、70、75、80 ℃和超聲時間 15、20、25、30、35 min，考察各單因素對蘆柑葉總黃酮提取率的影響，確定最佳的單因素工藝條件。

1.2.4 響應面試驗設計

根據所考察的單因素對蘆柑葉總黃酮提取率影響，在篩選出的最佳工藝條件基礎上，選取影響蘆柑葉總黃酮提取率的4個因素（液料比A、乙醇濃度B、超聲溫度C和超聲時間D）進行Box-Benhnken試驗設計并進行響應面優化，因素與水平見表1。

表1 響應面分析因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

1.2.5 蘆柑葉總黃酮的抗氧化活性測定

1.2.5.1 DPPH·清除能力的測定

分別在10 mL的比色管中加入2 mL不同質量濃度的蘆柑葉總黃酮溶液，并分別加入2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液，混合均勻反應30 min后，在517 nm處測得吸光度Ai；將2 mL 95%乙醇替代2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液，測得吸光度Aj；測定2 mL蒸餾水和2 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液混合液的吸光度A0；并以維生素C（VC）作對照，按下式計算得蘆柑葉總黃酮對DPPH·的清除率。

DPPH·清除率/%=[1-（Ai-A）j/A0]×100

1.2.5.2·OH清除率的測定

分別在10 mL的比色管中加入2 mL不同質量濃度的蘆柑葉總黃酮溶液，分別加入濃度均為9 mmoL/L的水楊酸-乙醇溶液2 mL和FeSO4溶液1 mL，混勻后加入1 mL 0.01%的H2O2溶液，并進行反應60 min，結束后，定容，測定在510 nm處的吸光度Ai；以蒸餾水代替H2O2溶液測得吸光度Aj；以蒸餾水代替蘆柑葉總黃酮溶液，測得吸光度 A0，以維生素 C（VC）作對照，按下式計算得蘆柑葉總黃酮對·OH的清除率。

·OH清除率/%=[1-（Ai-Aj）/A0]×100

1.2.6 數據處理

每組試驗重復3次，試驗結果以均值±標準差表示，用 Microsoft Excel 2007、Origin 8.0 和 Design-Expert 8.05b軟件進行試驗數據分析和繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 液料比的影響

液料比對總黃酮提取率的影響見圖1。

圖1 液料比對總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of liquid-to-material ratio on extraction yield of total flavonoid

從圖1中可以看出，當液料比在25∶1（mL/g）～35∶1（mL/g）區間變化時，蘆柑葉總黃酮提取率隨著液料比的增加而增大，這是因為液料比較小時，溶劑無法浸潤蘆柑葉顆粒，總黃酮溶出推動力不足，但液料比超過35∶1（mL/g）后，溶劑過多，會導致過濾、濃縮等后續步驟中總黃酮的損失[9]，從而使得提取率下降，因此液料比選擇為35∶1（mL/g）。

2.1.2 乙醇濃度的影響

乙醇濃度對總黃酮提取率的影響見圖2。

圖2 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoid

從圖2中可以看出，當乙醇濃度在65%～75%區間變化時，蘆柑葉總黃酮提取率隨著乙醇濃度的增加而增大，這是因為乙醇濃度小時，溶劑極性較大，水溶性較強，總黃酮溶出率較低，但當乙醇濃度超過75%時，乙醇濃度過高，大量醇溶性和脂溶性的溶出，加劇了與總黃酮的溶出競爭[10]，從而使得提取率下降，因此最適乙醇濃度為75%。

2.1.3 超聲溫度的影響

超聲溫度對總黃酮提取率的影響見圖3。

圖3 超聲溫度對總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on extraction yield of total flavonoid

從圖3中可以看出，當超聲溫度在60℃～70℃區間變化時，蘆柑葉總黃酮提取率隨著超聲溫度的升高而增大，這是因為超聲溫度較低時，溶劑中的分子熱運動較小，黃酮類物質的滲透、擴散與溶解能力較小，總黃酮提取率較低，但當超聲溫度超過70℃時，過高的溫度會使總黃酮中部分不穩定的結構發生氧化[11]，從而使得提取率下降。因此最適超聲溫度為70℃。

2.1.4 超聲時間的影響

超聲時間對總黃酮提取率的影響見圖4。

圖4 超聲時間對總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on extraction yield of total flavonoid

從圖4中可以看出，當超聲時間在15 min～25 min區間變化時，蘆柑葉總黃酮提取率隨著超聲時間的延長而增大，這是因為超聲時間較短時，蘆柑葉中黃酮類物質還沒來得及完全溶出，提取率較小，但當超聲時間過長時，黃酮類物質會發生氧化而結構受損，從而使得提取率下降[12]，因此最適超聲時間為25 min。

2.2 響應面法優化蘆柑葉總黃酮提取工藝

2.2.1 響應面設計及結果

根據所考察的單因素對蘆柑葉總黃酮提取率影響，設計了四因素三水平的Box-Behnken試驗并利用軟件進行響應面試驗分析。試驗方案及結果見表2，方差分析見表3。

對表2的Box-Behnken試驗設計結果，通過Design-Expert 8.05b軟件分析，得到以蘆柑葉總黃酮提取率（Y）為響應值，液料比（A）、乙醇濃度（B）、超聲溫度（C）和超聲時間（D）為自變量的多元回歸方程：Y=52.77+2.40A+1.06B-0.77C+0.86D-3.79AB+2.54AC+0.16AD-3.58BC-2.10BD+1.47CD-2.76A2-5.28B2-6.95C2-3.48D2。

由表3的二次回歸方程模型方差分析可以看出，該模型F=9.86，P＜0.000 1，表明該回歸模型具有較高的顯著性；失擬項F=3.78，P=0.106 0＞0.05，失擬項差異不顯著，表明該回歸方程的殘差均由隨機誤差引起，試驗誤差小。方程的回歸系數R2=0.908 0，表明有超過90%的試驗值可以利用該模型的預測值來解釋。根據F值及P值的分析得到各工藝因素對響應值的影響顯著性差異，其中一次項A，交互項AB、BC，二次項A2、B2、C2、D2對蘆柑葉總黃酮提取率影響極顯著（P＜0.01）；交互項AC對蘆柑葉總黃酮提取率影響顯著（P＜0.05），一次項 B、C、D，交互項 AD、BD、CD 對蘆柑葉總黃酮提取率均不顯著（P＞0.01），說明響應值與所考察的工藝條件之間不是簡單的線性關系。綜上分析，可以利用該二次回歸方程模型對蘆柑葉總黃酮的提取工藝進行分析與預測。

表2 響應面設計與試驗結果Table 2 Response surface design and experimental results

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

2.2.2 響應面分析

各因素之間的交互作用對響應值的影響顯著程度如圖5所示。

從圖5中可以看出液料比和乙醇濃度的響應面曲面的坡度最大、等高線最密，說明液料比和乙醇濃度的交互作用對響應值的影響最為顯著，而乙醇濃度和超聲溫度的響應面曲面坡度陡峭程度次之，等高線疏密程度也次之，說明乙醇濃度和超聲溫度對響應值的影響顯著性程度次之，同理可得，各因素間交互作用影響響應值（蘆柑葉總黃酮的提取率）的顯著性的順序為 AB＞BC＞AC＞BD＞CD＞AD。

2.2.3 最佳工藝驗證

通過軟件對回歸方程模型進行擬合分析，得到了蘆柑葉總黃酮的最佳提取工藝條件為：液料比38.44∶1（mL/g）、乙醇濃度73.75%、超聲溫度70.80℃和超聲時間26.24 min，蘆柑葉總黃酮提取率的預測值為53.51mg/g。為了試驗過程中參數控制的便利，將最佳工藝條件修正為液料比38∶1（mL/g）、乙醇濃度74%、超聲溫度71℃和超聲時間26 min，并進行重復3次驗證試驗，得到總黃酮的平均提取率為（53.19±0.28）mg/g，與預測值的相對誤差為0.6%，說明該二次回歸方程模型具有一定的準確性與可靠性，可用于蘆柑葉總黃酮的提取工藝的分析與預測。

2.3 蘆柑葉總黃酮的抗氧化活性

2.3.1 蘆柑葉總黃酮對·OH的清除能力

蘆柑葉總黃酮對·OH清除能力如圖6所示。

從圖6中可知，隨著蘆柑葉總黃酮和維生素C濃度的增加，·OH清除率逐漸提高，說明蘆柑葉總黃酮和維生素C的濃度與·OH清除率之間存在量效關系。根據圖6中的數據進行分析，得到蘆柑葉總黃酮和維生素C對·OH清除率的IC50分別為146.41 mg/L和93.39 mg/L，說明蘆柑葉總黃酮具有一定的抗氧化能力，但其抗氧化性能小于維生素C，是一種潛在的天然抗氧化劑。

2.3.2 蘆柑葉總黃酮對DPPH·的清除能力

蘆柑葉總黃酮對DPPH·的清除能力如圖7所示。

圖7 總黃酮和維生素C對DPPH·的清除能力Fig.7 Scavenging activity of total flavonoids and vitamin C on DPPH·

從圖7中可以看出，隨著蘆柑葉總黃酮和維生素C濃度的增加，DPPH·清除率逐漸提高，說明蘆柑葉總黃酮和維生素C的濃度與DPPH·清除率之間存在量效關系，根據圖7中的數據進行分析，得到蘆柑葉總黃酮和維生素C對DPPH·清除率的IC50分別為66.56 mg/L和47.83 mg/L，說明蘆柑葉總黃酮具有一定的抗氧化能力。

3 結論

通過單因素試驗和Box-Bohnken響應面試驗，得到最佳的蘆柑葉總黃酮提取工藝條件為：液料比38∶1（mL/g）、乙醇濃度74%、超聲溫度71℃和超聲時間26 min，并進行重復3次驗證試驗，得到總黃酮的平均提取率為（53.19±0.28）mg/g，與預測值的相對誤差為0.6%，說明該二次回歸方程模型具有一定的準確性與可靠性，可用于蘆柑葉總黃酮的提取工藝的分析與預測。蘆柑葉總黃酮對·OH和DPPH·的清除效果表明蘆柑葉總黃酮具有一定的抗氧化活性，與·OH和DPPH·的清除率之間存在量效關系，其對·OH和DPPH·清除率的IC50分別為146.41 mg/L和66.56 mg/L，說明蘆柑葉總黃酮是一種潛在的天然抗氧化劑。