響應(yīng)面法優(yōu)化樺褐孔菌多糖提取工藝及其抗氧化活性

徐曇燁，呂重寧，王曉波，杜昕美，王婷

（1.大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116023；2.中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九六七醫(yī)院博士后科研工作站，遼寧 大連 116021；3.沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016）

樺褐孔菌（Inonotus obliquus）又名樺樹茸，屬于多孔菌科褐臥孔菌屬，生長(zhǎng)于白樺、銀樺、榆樹等的樹皮下或砍伐后的樹木枯干上，是一種藥食兩用的木腐菌[1]。樺褐孔菌主要分布在北半球[2]。早在16世紀(jì)，俄羅斯民間用其治療消化系統(tǒng)癌癥等疑難雜癥。現(xiàn)代研究表明，樺褐孔菌具有抗腫瘤、降血糖、調(diào)節(jié)免疫、抗炎抗氧化等作用[3-7]。樺褐孔菌中含有多糖類、三萜類、甾體類、酚類、有機(jī)酸、多元醇等多種化學(xué)成分，其中多糖類成分被認(rèn)為是其主要活性物質(zhì)之一[8-10]。由于樺褐孔菌良好的保健功效，人們將其泡茶當(dāng)做日常保健飲品，也將其加入面包、糖果中[11]或被用作食品防腐劑[12]。隨著研究的深入，樺褐孔菌可被用于食品、藥學(xué)以及化工等產(chǎn)業(yè)，具有巨大的開發(fā)價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。

超聲波的空化作用使溶劑易于滲入細(xì)胞，加速物質(zhì)溶解，從而達(dá)到提取有效成分的目的[13]。相比于傳統(tǒng)的回流提取，超聲輔助提取法不僅可以縮短提取時(shí)間，并且能夠防止高溫導(dǎo)致的成分降解，是一種極為有效的提取方式[14-16]。響應(yīng)曲面法（response surface methodology，RSM）是一種應(yīng)用較廣的試驗(yàn)優(yōu)化方法，具有設(shè)計(jì)全面、試驗(yàn)精密度高等優(yōu)點(diǎn)，可以有效快速地確定多因子系統(tǒng)的最佳條件[17]。本試驗(yàn)基于Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取樺褐孔菌多糖的提取工藝，確定其最佳提取條件；并通過DPPH自由基清除試驗(yàn)評(píng)價(jià)其抗氧化活性，旨在為樺褐孔菌多糖的研究及開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樺褐孔菌：吉林長(zhǎng)白山，打粉，過60目篩，避光密封；維生素 C（純度＞99%）、DPPH（純度＞99%）：上海源葉生物科技有限公司；葡萄糖、苯酚、濃硫酸、無水乙醇、牛血清蛋白、氫氧化鈉：天津市大茂化學(xué)試劑廠；考馬斯亮藍(lán)G-250：北京索萊寶科技有限公司；以上試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ5200B型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；FD-1-50真空冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；Z326K離心機(jī)：德國(guó)赫默公司；SYNERGY|H1多功能微孔檢測(cè)儀：美國(guó)博騰儀器有限公司；Milli-Q水純化系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

取樺褐孔菌粉末，加入4倍體積90%的乙醇溶液，80℃超聲2次，每次20 min，抽濾，濾渣在50℃的水浴加熱揮干殘留的乙醇，得到預(yù)處理樺褐孔菌粉末。

1.3.2 樺褐孔菌多糖提取工藝流程

預(yù)處理的樺褐孔菌粉末→加入蒸餾水超聲輔助提取→離心，取上清液→減壓濃縮→乙醇沉淀→離心，取沉淀→冷凍干燥→樺褐孔菌粗多糖

1.3.3 樺褐孔菌多糖提取率的計(jì)算

樺褐孔菌多糖含量的測(cè)定采用苯酚-硫酸法[18]。以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，490 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度（y）為縱坐標(biāo)，多糖質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=4.78x-0.013 4（R2=0.995 81），線性范圍為0.01 mg/mL～0.10mg/mL。根據(jù)公式（1）計(jì)算多糖提取率。

式中：x為標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出的質(zhì)量濃度，mg/mL；V1為配制的溶液體積，mL；V2為取樣量，mL；m 為樺褐孔菌粉末質(zhì)量，g。

1.3.4 超聲波輔助提取法的單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

利用超聲波輔助方法，蒸餾水為溶劑，以超聲時(shí)間、超聲溫度、液料比、提取次數(shù)為考察因素進(jìn)行影響樺褐孔菌多糖提取率的單因素試驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面法進(jìn)行提取工藝的優(yōu)化設(shè)計(jì)。

1.3.5 樺褐孔菌粗多糖中蛋白含量的測(cè)定

樺褐孔菌粗多糖中蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法[19]。以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品，595 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度（y）為縱坐標(biāo)，蛋白質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=2.46x+0.008 5（R2=0.991 86），線性范圍為 0～0.2 mg/mL。

1.3.6 樺褐孔菌多糖純化工藝流程

樺褐孔菌粗多糖粉末→溶于蒸餾水→加入10%三氯乙酸（tri choroacetic acid，TCA）溶液攪拌→離心，取上清液→減壓濃縮→乙醇沉淀→離心,取沉淀→冷凍干燥→樺褐孔菌精制多糖

1.3.7 樺褐孔菌多糖對(duì)DPPH自由基清除作用

參考操麗麗等[20]的方法，具體操作如下：將100 μL不同濃度的精制多糖溶液與 2 900 μL 120 μmol/L DPPH自由基儲(chǔ)備液在37℃避光反應(yīng)30 min，利用酶標(biāo)儀測(cè)定517 nm下的吸光度A樣品。以維生素C作為陽性對(duì)照，同時(shí)測(cè)定空白組（樣品不加DPPH）吸光度A空白和陽性對(duì)照組樣品吸光度A對(duì)照。

根據(jù)公式（2）計(jì)算DPPH自由基清除率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析處理，試驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

取處理好的樺褐孔菌粉末0.5 g，加入10 mL蒸餾水，在60℃溫度下，超聲輔助提取3次，分別超聲10、20、30、40、50 min，結(jié)果如圖 1 所示。

圖1 超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic time on the yield of polysaccharides from I.obliquus

由圖1可知，在一定范圍內(nèi)樺褐孔菌多糖提取率隨著超聲時(shí)間的增加而增大，當(dāng)超聲時(shí)間到達(dá)30 min時(shí)，多糖提取率達(dá)到了最高值，但隨著超聲時(shí)間的增加，多糖提取率不再增加。

2.1.2 超聲溫度對(duì)多糖提取率的影響

取處理好的樺褐孔菌粉末0.5 g，加入10 mL蒸餾水，分別在 20、30、40、50、60 ℃溫度下，超聲輔助提取3次，每次30 min，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知隨著溫度的升高，樺褐孔菌多糖提取率增加，當(dāng)溫度達(dá)到50℃時(shí)，多糖提取率達(dá)到了最高點(diǎn)，之后溫度升高，樺褐孔菌多糖提取率呈下降趨勢(shì)。說明在超聲條件下，過高的溫度不利于多糖的析出。

2.1.3 液料比對(duì)多糖提取率的影響

取處理好的樺褐孔菌粉末0.5 g，分別按液料比為15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1（mL/g）加入蒸餾水，在 60℃溫度下，超聲輔助提取3次，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，液料比為20∶1（mL/g）時(shí)多糖提取率達(dá)到最大，此后隨著液體量的增大，多糖提取率不再增加。故選擇液料比20∶1（mL/g）。

圖2 超聲溫度對(duì)多糖提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on the yield of polysaccharides from I.obliquus

圖3 液料比對(duì)多糖提取率的影響Fig.3 Effect of liquid/solid ratio on the yield of polysaccharides from I.obliquus

2.1.4 提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響

取處理好的樺褐孔菌粉末0.5 g，加入10 mL蒸餾水，在 60 ℃溫度下，超聲輔助提取 1、2、3、4、5 次，結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取次數(shù)對(duì)多糖提取率的影響Fig.4 Effect of extract times on the yield of polysaccharides from I.obliquus

由圖4可知，提取次數(shù)越多，多糖提取率越大，但是提取超過3次之后，多糖提取率增加幅度不明顯。為了節(jié)約資源，提高效率，將提取設(shè)為3次。

2.2 采用響應(yīng)面法優(yōu)樺褐孔菌多糖提取工藝

2.2.1 多糖提取試驗(yàn)方案和因素水平

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)之上，固定提取3次，采用三因素三水平，以多糖提取率作為響應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方案分別進(jìn)行了17組試驗(yàn)，其中1～12組為析因試驗(yàn)，13～17組為中心試驗(yàn)。結(jié)果見表1。

表1 響應(yīng)面分析試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Design and results for response surface method

2.2.2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

采用Design Expert（10.0.7）軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程為Y=3.91+0.035A+0.11B+0.1C+0.042AB-0.032AC-0.033BC-0.33A2-0.30B2-0.31C2。回歸方程一次項(xiàng)中各項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值的大小反映了各因素對(duì)響應(yīng)值的影響程度，系數(shù)的正負(fù)反映了影響的方向。由方程可知，影響樺褐孔菌多糖提取率的因素主次順序如下：B＞C＞A。對(duì)方程進(jìn)行回歸方差分析，結(jié)果見表2。

由表2的分析結(jié)果可以看出，模型P＜0.01，說明二次多項(xiàng)模型具有極顯著性，失擬項(xiàng)不顯著，模型決定系數(shù)R2=0.903 6，表明模型擬合度良好，可知該模型與實(shí)際試驗(yàn)有著良好的擬合關(guān)系。此外，一次項(xiàng)A不顯著，B、C 顯著；二次項(xiàng) A2、B2、C2極顯著；交互項(xiàng) AB、AC、BC項(xiàng)均不顯著。

2.2.3 提取工藝的響應(yīng)曲面分析和優(yōu)化

圖5～圖7分別為超聲時(shí)間、超聲溫度、液料比三因素影響樺褐孔菌多糖提取率的響應(yīng)面和等高線圖。

綜合分析響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果并依據(jù)回歸模型確定樺褐孔菌多糖的最佳提取工藝參數(shù)為：超聲時(shí)間30.575min，超聲溫度51.864℃，液料比 20.758∶1（mL/g），此時(shí)理論上多糖提取率為3.93%。為驗(yàn)證試驗(yàn)的可靠性，并考慮可操作性，將最優(yōu)條件修改為：超聲時(shí)間31 min，超聲溫度 52 ℃，液料比 21 ∶1（mL/g），超聲輔助提取3次，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得到的樺褐孔菌多糖提取率為（3.81±0.19）%，實(shí)際值與理論預(yù)測(cè)值相對(duì)誤差為3.1%。此結(jié)果與預(yù)測(cè)值比較接近，說明此模型真實(shí)可靠，對(duì)樺褐孔菌多糖的提取工藝優(yōu)化具有一定指導(dǎo)意義。

表2 回歸模型方差分析Table 2 Analysis of variance for the developed polynomial model

圖5 超聲時(shí)間和超聲溫度的響應(yīng)面和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots of ultrasonic time and temperature

圖6 超聲時(shí)間和液料比的響應(yīng)面和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots of ultrasonic time and liquid/solid ratio

圖7 超聲溫度與液料比的響應(yīng)面與等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots of ultrasonic temperature and liquid/solid ratio

2.3 樺褐孔菌粗多糖中多糖和蛋白含量

取10 mg粗多糖，溶于10 mL蒸餾水中，平行試驗(yàn)3次，采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量分別為1.86、1.90、1.93 mg/mL。采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量分別為1.39、1.34、1.43 mg/mL，樺褐孔菌粗多糖中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為19.0%（以葡萄糖計(jì)），蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13.9%（以牛血清蛋白計(jì)）。結(jié)果表明，樺褐孔菌粗多糖粉末中除含有多糖和蛋白以外，還有大量其它成分。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，推測(cè)為皂苷、多酚等水溶性成分[21-22]。

2.4 樺褐孔菌多糖DPPH自由基清除能力

樺褐孔菌多糖的DPPH自由基清除能力見圖8。

人類的多種疾病均與自由基有關(guān)，包括炎癥、心腦血管疾病、癌癥、糖尿病等等。自由基屬于強(qiáng)氧化劑，一旦在人體內(nèi)蓄積過量，就會(huì)造成組織損傷或加速細(xì)胞老化甚至凋亡[23-24]。抗氧化作用可消除自由基，對(duì)人體正常的新陳代謝有重要意義。如圖8所示，樺褐孔菌多糖對(duì)DPPH自由基有一定的清除作用，但作用不如維生素C。當(dāng)樺褐孔菌多糖濃度較低時(shí)，DPPH自由基清除率隨著濃度的增大而增加；在5 mg/mL時(shí)，清除率最大，達(dá)到61.39%。此后隨著多糖濃度的增大，清除率反而下降，此結(jié)果表明過高濃度的多糖不利于DPPH自由基的消耗。

圖8 樺褐孔菌多糖對(duì)DPPH自由基的清除作用Fig.8 Scavenging effect of polysaccharide from I.obliquus on DPPH free radical

3 結(jié)論

采用超聲輔助法提取樺褐孔菌多糖，該方法操作簡(jiǎn)便，節(jié)約成本。利用響應(yīng)面法對(duì)超聲輔助提取多糖的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，模型擬合度良好。優(yōu)化的工藝參數(shù)結(jié)果為：超聲時(shí)間31 min，超聲溫度52℃，液料比為21∶1（mL/g），此條件下，樺褐孔菌多糖提取率為（3.81±0.19）%，工藝驗(yàn)證試驗(yàn)表明此模型真實(shí)可靠，可以用于樺褐孔菌多糖提取的工藝優(yōu)化。采用苯酚-硫酸法和考馬斯亮藍(lán)法分別對(duì)樺褐孔菌粗多糖中的多糖和蛋白進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示樺褐孔菌粗多糖中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為19.0%（以葡萄糖計(jì)），蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13.9%（以牛血清蛋白計(jì)）。DPPH自由基清除試驗(yàn)說明樺褐孔菌精制多糖具有一定的抗氧化能力，且濃度在5 mg/mL時(shí)，清除率最大為61.39%。該研究為樺褐孔菌及其多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。