水產品中志賀氏菌雙抗夾心ELISA檢測方法建立與應用

朱芳茜，何擴*，張秀媛，李育峰，陳一，王云峰，王碩，趙瑞平

（1.河北省農產品食品質量安全與檢測重點實驗室，河北北方學院，河北 張家口 075000；2.南開大學，天津 300000）

志賀氏菌（Shigella）通稱痢疾桿菌，在我國感染性腹瀉病原菌中高居首位，它主要侵染人體的結腸，引發腸道炎癥、潰瘍以及頻繁的黏液性血性腹泄，少數嚴重可導致驚厥、低鈉血癥、低血糖、溶血性尿毒綜合征、腸穿孔和死亡[1-2]。每年全世界有1.6億人感染此類疾病，約有110萬人死亡，其中5歲以下兒童為主要受害者[3]。由于水源或食品受到志賀氏菌污染會引起痢疾、腹瀉等疾病[4]。因此，建立一種快速、準確的志賀氏菌檢測方法顯得尤為重要。目前，志賀氏菌常用檢測方法主要有兩大類：一是傳統生化培養法，二是快速檢測法。傳統生化培養法結果準確，且無復雜設備等特點，但由于步驟繁瑣、周期長、試劑繁多等缺陷，遠遠不能滿足現代快速檢測的需要[5-6]。基于聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術、分子生物學原理的各種快速檢測法具有準確等優點，但由于其需要昂貴的試劑和設備、有時需帶回專業實驗室檢測等缺陷，無法滿足現場分析的需要[7-9]。經典的免疫學分析方法具備靈敏度高、特異性強、周期短、操作簡單和成本低等優點，廣泛用于食品有毒有害物的檢測中，其中酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）最為常用[10]。針對以上情況，本研究以廣泛污染水產品的志賀氏菌抗原免疫動物獲取多克隆抗體，在此基礎上建立雙抗夾心ELISA方法，實現對水產樣品的志賀氏菌定性及定量快速檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、卵清蛋白（ovalbumins，OVA）、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑：美國 Sigma 公司；石蠟油、3，3′，5，5′-四甲基聯苯胺（3，3′，5，5′-tetramethylbenzidine，TMB）：Biosharp 公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）：北京博奧森生物技術有限公司；志賀氏菌培養基、聚乙二醇 1500 （polyethylene glycol1500，PEG1500）：Gibco公司；新西蘭大耳白兔（雌性，兩月齡）：軍事科學研究院；志賀氏菌、大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌及副溶血弧菌菌株：河北省農產品食品質量安全檢測重點實驗室保存制備；LB肉湯培養基：青島天祺生物科技有限公司；蛋白純化柱（Protein A-Sepharose 4B）：美國Amersham公司；扇貝：市購；其它試劑均為分析純級。

1.2 儀器與設備

Thermo Fisher Multiskan酶標儀：美國thermo公司；RH-KT加熱磁力攪拌器：美國IKA公司；Profinia蛋白純化儀、Powerpac蛋白電泳儀：美國BIO-RAD公司；SPH-300D恒溫搖床：上海世平實驗設備有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 免疫原制備

將實驗室保存的志賀氏菌（ATCC12022）活化后，挑取菌種接種到LB肉湯培養基（200 mL）中，搖床200r/min，37℃振蕩培養24h，培養后的菌液5000r/min離心10min，收集的菌體用0.01mol/LpH7.4磷酸緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）洗滌兩次，加入 30 mL 0.5%福爾馬林，室溫20℃下作用24 h滅活菌體，5 000 r/min 離心 10 min，收集菌體[11-12]。

1.3.2 抗志賀氏菌多克隆抗體制備

以滅活的志賀氏菌為免疫原，選擇新西蘭大白兔（雌性，兩月齡）進行背部皮下多點免疫。首免時，50 μL菌液與等體積的弗氏完全佐劑乳化后，按劑量100μL/只進行注射；兩周后，同樣劑量加強免疫，佐劑換成為弗氏不完全佐劑，之后進行第3次免疫。每次免疫后10 d，靜脈采血檢測血清的效價。待血清中抗體效價達到80 000左右后動脈取血，采用以Protein A-Sepharose 4B作親合層析介質純化抗血清并用Western Blot檢測抗體，最后測定其蛋白濃度后分裝保存于-20℃冰箱中作為捕獲抗體[13]。

1.3.3 酶標抗體制備

稱取4 mg HRP溶于0.5 mL蒸餾水中，加入1 mL 0.06mol/LNaIO4新配溶液，4℃下磁力攪拌混勻30min。加入0.6 mL 0.16 mol/L乙二醇溶液，4℃下磁力攪拌再次混勻30 min。加入4 mg抗志賀氏菌多克隆抗體，混合均勻后裝入透析袋中，4℃下放入1 000 mL碳酸鹽緩沖液（0.05 mol/L，pH9.6）中透析 12 h，中間換取緩沖液3次。將透析袋中液體取出，加入0.2 mL 5 mg/mL NaBH4溶液，4℃下緩慢混勻2 h。然后采用飽和硫酸銨沉淀法純化，沉淀物用1 mL PBS溶解，4℃下透析12 h，中間換取緩沖液3次。后加入等體積甘油，-20℃冰箱中保存作為檢測抗體[14-15]。

1.3.4 雙抗夾心ELISA檢測方法的建立

采用棋盤滴定法優化捕捉抗體與檢測抗體稀釋度，將純化后的志賀氏菌多克隆抗體按照優化稀釋度稀釋4℃包被過夜（100 μL/孔），磷酸鹽吐溫緩沖液（phosphate tween buffered solution，PBST） 洗滌 3 次，0.5%脫脂乳粉封閉液封閉（100 μL/孔），37℃封閉 1 h。棄去封閉液，PBST洗滌3次，加入梯度稀釋的志賀氏菌菌液，100 μL/孔，并設置空白對照和陰性對照，37℃孵育30 min，PBST洗滌4次。將酶標抗體按優化結果稀釋，100 μL/孔，37 ℃孵育 1 h，PBST 洗滌 4 次，加入TMB底物顯色液進行顯色，100μL/孔，37℃孵育15min；加入終止液（2 mol/L H2SO4），50 μL/孔，終止顯色反應；在酶標儀上測定OD450nm值[16]。

1.3.5 雙抗夾心ELISA檢測志賀氏菌的特異性

將大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌及副溶血弧菌稀釋成1×106cfu/mL，采用建立的雙抗夾心ELISA方法進行檢測。設立志賀氏菌為陽性對照，同時作陰性對照，重復試驗3次，得出平均值，以檢驗雙抗夾心ELISA體系的特異性。

1.3.6 人工接種扇貝的檢測

扇貝是經檢測不含志賀氏菌的陰性樣品。扇貝樣品的制備：無菌條件下，將扇貝肉打成肉泥，稱取扇貝肉泥10 g，接入志賀氏菌不同濃度的菌懸液，按10、1、0.1 cfu/g樣品接種量接種，并以無菌生理鹽水作陰性對照。在上述各樣品中加入100 mL肉湯培養基，混勻，37℃，轉速180 r/min的恒溫搖床上分別增菌培養5、10、20 h后取樣檢測OD值，同時用空白血清作陰性對照，大于陰性對照2.1倍（實驗組OD值∶對照組OD值≥2.1）則為陽性[17]。

1.4 數據處理

采用SPSS軟件進行數據處理分析，試驗數據均以M±SD表示。

2 結果與分析

2.1 志賀氏菌多克隆抗血清效價的測定

選擇4只新西蘭大白兔（雌性，兩月齡）分別編號為1、2、3、4。將制備好的免疫原同時免疫4只大白兔，每次免疫后10 d，靜脈采血后，采用間接ELISA對志賀氏菌免疫大白兔的抗血清進行效價測定，其中3號大白兔的抗血清效價最好，3號大白兔的抗血清效價測定結果見圖1。

圖1 3號大白兔的抗血清效價Fig.1 Antiserum titer of the third rabbit

由圖1可以看出，3號大白兔隨著免疫次數的增加，抗血清效價都有不同程度的增長，尤其是在第4次免疫后，其抗血清效價提高到81 000左右，最終選擇3號大白兔的血清作為捕獲抗體。

2.2 抗體純化與檢測

抗體純化與Western Blot免疫檢測結果見圖2。

圖2 抗體純化與Western Blot免疫檢測Fig.2 Antibody purification and immunologic detection of Western Blot

由圖2A可知，圖中出現兩條清晰的條帶，一條大小為55 kDa，為重鏈帶。另一條大小為26 kDa，為輕鏈帶。且聚丙酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）中沒有明顯的雜帶，說明其純化效果好。取志賀氏菌菌體懸液進行12%SDS-PAGE，轉聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜后用純化后的抗血清進行Western Blot免疫檢測，結果如圖2B所示。從圖中可以看出，每個菌株都出現了多條條帶，說明制備的志賀氏菌多克隆抗體對菌體有較好的識別能力，同時說明志賀氏菌菌株中有多個蛋白可以刺激機體產生免疫反應。

2.3 雙抗夾心體系

棋盤滴定優化結果見表1。

表1 棋盤滴定法優化OD結果Table 1 OD results of checkerboard titration

從表1可以看出，當捕捉抗體和檢測抗體的濃度分別為3.125 g/mL和2.5 μg/mL時，測定的OD值為1.007，這個數值在所有OD值中最接近1。表明該體系志賀氏菌多克隆抗體作為捕獲抗體的最佳包被質量濃度為3.125 g/mL，辣根過氧化物酶標記志賀氏菌多克隆抗體作為檢測抗體的最佳稀釋質量濃度為2.5 μg/mL。

2.4 雙抗夾心體系標準曲線建立

根據雙抗夾心體系優化的結果，最終確定的工作條件：捕獲抗體的包被量為0.3125 g/孔，4℃下包被過夜，0.5%脫脂乳粉封閉液封閉，37℃封閉1 h，加入志賀氏菌菌液，從1×107cfu/mL開始用PBS緩沖液10倍梯度進行稀釋，100 μL/孔室溫20℃下反應1 h，加入酶標抗體，37℃孵育1 h，37℃顯色15 min。最后用終止液終止反應，用酶標儀在450 nm下讀取吸光度值，繪制標準曲線見圖3。根據計算可得線性方程為y=6×10-7x+0.142，根據方程可計算檢測限（limit of detection，LOD）為4.12×104cfu/mL，檢測曲線的線性范圍為 4.12×104cfu/mL～3.4×106cfu/mL。

圖3 志賀氏菌雙抗夾心ELISA標準曲線Fig.3 Standard curve line of double antibody sandwich ELISA

2.5 雙抗夾心體系的特異性

在雙抗夾心ELISA體系中檢測大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌及副溶血弧菌，同時檢測陰性對照與陽性對照志賀氏菌，結果如圖4所示。

由圖4可知，志賀氏菌陽性對照正常顯色并檢出，而其它菌株均不顯色。說明建立的雙抗夾心ELISA體系與大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌及副溶血弧菌無交叉反應性，具有良好的特異性。

圖4 檢測不同菌屬菌株的交叉反應Fig.4 detection of the cross-reaction of different strains of bacteria

2.6 扇貝樣品人工接種志賀氏菌檢測

扇貝樣品人工接種志賀氏菌檢測試驗結果見表2。

表2 雙抗夾心ELISA檢測扇貝中人工接種的志賀氏菌Table 2 Detection of Shigella in artificial inoculation of scallop by sandwich ELISA

由表2可以得出，當樣品增菌培養5 h時，取樣經雙抗夾心體系檢測獲得試驗組和對照組OD值，根據ELISA檢測判斷標準，當接種量為0.1、1 cfu/100 g時，試驗組/對照組＜2.1，結果為陰性，當接種量為10 cfu/100 g時，呈弱陽性。增菌培養10 h取樣檢測時，接種量為0.1 cfu/100 g和1 cfu/100 g的扇貝樣品試驗組/對照組＜2.1，結果為陰性，接種量為10 cfu/100 g的扇貝樣品試驗組/對照組≥2.1，可檢測到志賀氏菌的存在。當增菌培養20 h時取樣檢測，接種量為0.1 cfu/100 g、1 cfu/100 g和10 cfu/100 g的扇貝樣品試驗組/對照組≥2.1，結果均為陽性。因此建立的雙抗夾心ELISA檢測體系的檢測樣品，經過10 h后增菌志賀氏菌檢出限（LOD）為105cfu/mg。

3 結論

以志賀氏菌多克隆抗體為捕獲抗體進行包被，以HRP標記抗志賀氏菌多克隆抗體作為檢測抗體，建立了志賀氏菌的雙抗夾心ELISA檢測體系，建立的標準曲線線性較好，R2=0.999 4，檢測限（LOD）為 4.12×104cfu/mL，檢測曲線的線性范圍為4.12×104cfu/mL～3.4×106cfu/mL。在扇貝樣品的添加試驗中，建立的雙抗夾心ELISA方法進行檢測，接種量105cfu/mg的樣品在培養10 h后可檢出陽性結果，表明本方法具有良好的靈敏度與特異性。