GC-MS測(cè)定不同采收期酸棗仁中脂肪油成分

馬東來(lái)，李新蕊，司明東，溫子帥，鄭玉光，邱峰

（1.河北中醫(yī)學(xué)院河北省中藥炮制技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 石家莊 050200；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 300193）

酸棗仁為鼠李科植物酸棗 [Ziziphous jujuba Mill.Var.Spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chow]的干燥成熟種子，為藥食同源的傳統(tǒng)中藥，具有養(yǎng)心補(bǔ)肝、寧心安神、斂汗、生津等功效[1]?，F(xiàn)代化學(xué)及藥理研究表明[2-3]，酸棗仁中主要有效成分有脂肪油、三萜皂苷、黃酮、多糖、生物堿和氨基酸等，其中酸棗仁中脂肪油在失眠、陣痛等領(lǐng)域療效顯著，有“東方睡油”美譽(yù)[4]。隨著酸棗仁臨床用藥需求的增加，部分酸棗仁產(chǎn)區(qū)藥農(nóng)為了爭(zhēng)取最大的經(jīng)濟(jì)效益，出現(xiàn)嚴(yán)重的“搶青”現(xiàn)象，導(dǎo)致酸棗仁藥材顆粒不飽滿、質(zhì)量不合格，嚴(yán)重影響了酸棗仁臨床療效[5]。因此規(guī)范和確定酸棗仁最佳采收時(shí)間對(duì)于保證酸棗仁質(zhì)量有重要意義。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)為研究中藥材中脂肪油類成分提供便捷方法[6-7]，雖對(duì)酸棗仁中脂肪油的GC-MS技術(shù)測(cè)定已有相關(guān)研究[8-9]，但尚未見采用GC-MS對(duì)不同采收期酸棗仁中脂肪油成分進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析和確定采收期的報(bào)道。因此本課題組在前期研究基礎(chǔ)上，利用GC-MS分析不同采收期酸棗仁中脂肪油成分進(jìn)行動(dòng)態(tài)分析，以期為酸棗仁最佳采收時(shí)間的優(yōu)選提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸棗仁分別在7月15日（果實(shí)半紅期，S1）、8月15日（果實(shí)脆熟期，S2）和9月15日（果實(shí)完熟期，S3）采自河北省邢臺(tái)縣東川口村，經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院鄭玉光教授鑒定為真品；正己烷（色譜純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent 7890A-5977B）：美國(guó)安捷倫科技有限公司；電子分析天平（BSA224SCW）：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；超聲波清洗儀（KQ-250DE）：昆山市超聲儀器有限公司；加熱磁力攪拌器（RCT Basic）：德國(guó)IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 酸棗仁脂肪油成分提取

精密稱取3個(gè)時(shí)期酸棗仁粉末（過(guò)60目篩）2.0 g，置索氏提取器中，加入正己烷100 mL，水浴回流提取4 h，減壓蒸出溶劑，得黃綠色脂肪油，稱重，計(jì)算得率。在上述脂肪油中加入5 mL 0.5 mol/L NaOH的甲醇溶液，回流反應(yīng)1 h后，加入8 mL BF3乙醚溶液繼續(xù)反應(yīng)30 min，反應(yīng)結(jié)束后，用正己烷萃取和飽和NaCl溶液洗滌有機(jī)相，有機(jī)相用無(wú)水Na2SO4干燥，并定容于25mL容量瓶中，備用。

1.3.2 GC-MS色譜條件

氣相色譜條件[10]為色譜柱：HP-5柱（50m×250μm×0.25 μm）；程序升溫：起始溫度 60 ℃，保持 2 min，以3℃/min升溫至165℃，再以20℃/min升溫至280℃，保持5 min；載氣為高純氮?dú)?，載氣流量為1.0 mL/min；進(jìn)樣量 1 μL，分流進(jìn)樣，分流比為 10∶1；汽化室溫度為250℃。

質(zhì)譜條件為EI離子源；電子能量70 eV；離子源溫度230℃；四極桿質(zhì)量監(jiān)測(cè)器，溫度150℃；掃描范圍m/z：40 amu～500 amu；溶劑延遲 4 min；載氣為氦氣（純度99.999%）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

經(jīng)GC-MS分析得到3個(gè)采收期的酸棗仁樣品的總離子流圖，各峰經(jīng)質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索并與NIST 11標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜檢索庫(kù)和參考有關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行定性分析，采用峰面積歸一法測(cè)定各成分的相對(duì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 GC-MS色譜條件方法學(xué)考察

對(duì)3個(gè)采收期的酸棗仁樣品的代表性總離子流圖如圖1所示。

酸棗仁脂肪油成分及其相對(duì)百分含量見表1。

圖1 不同時(shí)期酸棗仁中脂肪油組分的GC-MS代表性總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of fatty oil components of ziziphi spinosae semen in three seasons

表1 3個(gè)時(shí)期酸棗仁脂肪油化合物的組成和相對(duì)含量Table 1 The compositions a-relative contents of fatty oil components among ziziphi spinosae semen with three seasons processed

2.1.1 精密度試驗(yàn)

取酸棗仁樣品（S3），按“1.3.1”項(xiàng)條件下制備供試品，在“1.3.2”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，以棕櫚酸甲酯（峰a）為參照，測(cè)得6個(gè)共有峰（相對(duì)含量＞1%）的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）值均＜0.47%，表明儀器精密度良好。

2.1.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取酸棗仁樣品（S3），共 6份，按“1.3.1”項(xiàng)條件下制備供試品，在“1.3.2”項(xiàng)色譜條件下分別進(jìn)樣，以棕櫚酸甲酯（峰a）為參照，測(cè)得6個(gè)共有峰（相對(duì)含量＞1%）的相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均＜0.86%，相對(duì)峰面積的RSD值均＜2.76%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同批酸棗仁樣品（S3）的供試品溶液，在“1.3.2”項(xiàng)色譜條件下分別于 0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，以棕櫚酸甲酯（峰a）為參照，測(cè)得6個(gè)共有峰（相對(duì)含量＞1%）的相對(duì)保留時(shí)間的RSD值均＜0.56%，相對(duì)峰面積的RSD值均＜2.32%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2 不同時(shí)期酸棗仁中脂肪油的組成特點(diǎn)

由表1可知，酸棗仁S1、S2和S3樣品中脂肪油量分別為23.17%、28.35%和29.25%，共檢出并鑒定到29種脂肪油成分，酸棗仁S1、S2和S3樣品中分別檢測(cè)出20、17和23種脂肪油成分，包括脂肪酸類14種、碳?xì)浠衔?種、醇類4種、醛類1種、含氮化合物1種和含硫化合物1種。

脂肪油成分的種類與相對(duì)含量隨著時(shí)間的推移逐漸增加，其中酸棗仁S3樣品中脂肪油成分種類與含量均為最多，共23種，總含量為292.5 mg/g，其次為酸棗仁S1樣品，共20種，含量231.7 mg/g，酸棗仁S2樣品中最少，共17種，含量283.5 mg/g。

由圖1和表1可知，酸棗仁S1、S2和S3樣品中脂肪油物質(zhì)主要以脂肪酸類、碳?xì)浠衔锖痛碱惢衔餅橹?，其中酯類物質(zhì)種類最多，脂肪油成分含量較高，在酸棗仁 S1、S2、S3 中分別檢測(cè)鑒定到 11、11、13 種，相對(duì)含量分別為92.85%、97.29%、95.99%；其次是碳?xì)浠衔?，在酸棗仁S1、S2、S3中分別檢測(cè)鑒定到4、1、7種，相對(duì)含量分別為1.29%、0.36%、1.43%；再是醇類物質(zhì)，在酸棗仁S1、S2、S3中分別檢測(cè)鑒定到 3、4、2種，相對(duì)含量分別為2.10%、0.71%、0.40%。

3 結(jié)論與討論

酸棗仁是我國(guó)傳統(tǒng)的中藥，其種植和用藥歷史已有幾千年，近年開發(fā)的酸棗仁油被譽(yù)為“東方睡油”，具有較好的治療失眠的功效。酸棗仁的生長(zhǎng)發(fā)育階段對(duì)其有效成分調(diào)控和積累，其中脂肪性類化合物的種類、數(shù)量和含量隨著酸棗仁的發(fā)育而逐漸升高，在果成熟時(shí)達(dá)到高峰[9]。本試驗(yàn)采用GC-MS技術(shù)對(duì)河北省道地酸棗仁不同采收期的脂肪油成分進(jìn)行測(cè)定，共鑒定出29種成分，分為不飽和脂肪酸類、飽和脂肪酸類、碳?xì)浠衔锖痛碱惢衔镞@4大類組分。3個(gè)不同時(shí)期酸棗仁分別檢測(cè)出20、17、23種脂肪油成分，由此可見脂肪油成分在種類數(shù)量上相差不大，但各類脂肪油成分的相對(duì)含量存在一定差異。不同時(shí)期的10個(gè)共有脂肪油成分表現(xiàn)出4種變化趨勢(shì)：（1）呈現(xiàn)出持續(xù)上升的趨勢(shì)有3種：反式油酸甲酯、順式-11-二十碳烯酸甲酯、山崳酸甲酯；（2）呈現(xiàn)出持續(xù)下降的趨勢(shì)有3種：棕櫚酸甲酯、花生酸甲酯、硬脂酸甲酯；（3）呈現(xiàn)出高-低-高的復(fù)雜變化有3種：硫酸二乙酯、葉綠醇、2，5-二叔丁基酚；（4）呈現(xiàn)出低-高-低的變化趨勢(shì)有3種：亞油酸甲酯、反油酸乙酯、花生酸甲酯。

酸棗仁中的許多飽和/不飽和脂肪酸類物質(zhì)對(duì)人類健康有益，有很強(qiáng)商業(yè)價(jià)值，越來(lái)越受到醫(yī)藥、保健品企業(yè)的重視。本研究初步闡述了酸棗仁不同時(shí)期脂肪油成分的變化，其中S3樣品中脂肪油量最高，且鑒定出23種成分。該結(jié)論與課題組前期[11]對(duì)酸棗仁的高效液相色譜分析斯皮諾素和酸棗仁皂苷A的結(jié)果十分相似，即9月中旬后酸棗果實(shí)變?yōu)槿t后其含量最高，也進(jìn)一步確定酸棗仁在9月中旬后再進(jìn)行采收比較合理。