柿葉片中單寧含量的動態變化研究＊

李泯錕，程洪斌，宋 超，竇思遠，王 耘，黃 雯

（1.金陵科技學院園藝園林學院，江蘇 南京210038；2.南京市蔬菜科學研究所，江蘇 南京210042）

柿葉味苦、澀，富含多酚類、黃酮類、萜類、鞣質等化學成分[1]，具有活血化瘀、降血壓等功效[2]，已被開發為保健柿葉茶[3-4]。可溶性單寧是引起澀味的主要物質，也存在于柿果實中[5]，是一種重要的食品功能成分，廣泛應用于食品、醫療等領域[6]。目前柿單寧提取多以果實為原料，柿葉利用較少，而韓衛娟等[5]的研究結果顯示部分品種的葉片可溶性單寧年均含量高于果實。因此柿葉可作為提取柿單寧的原料，減少對果實資源的浪費。

黑柿是黑色柿品種，果實含糖量高，軟化后味濃甜，枝條拱形生長，具有觀賞價值[7]。黑柿分布少，關于黑柿葉單寧含量動態變化和成分相關的報道極少，前期的研究發現黑柿葉中單寧含量較紅柿葉高，是一種較好的新資源。本研究以黑柿和紅柿柿葉為主要測定對象，對比不同時期葉片中可溶性單寧含量的變化規律，鑒定單寧含量最高時期的組分，該結果無論對最佳采樣時期，還是對原材料的選擇都具有重要的指導作用，為充分開發黑柿子資源中功能性成分提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

供試材料：紅柿（富有甜柿）、黑柿。從2019-07—2019-11采樣于金陵科技學院園藝站，共計12 次。液氮速凍后，置于-80 ℃保存。待測樣品于95 ℃下烘干至恒重，研磨成粉末過40 目篩，密封置于干燥器中，待后續測定實驗使用。

1.2 材料與儀器

材料包括沒食子酸標準品（HPLC≥98%，合肥博美生物科技有限責任公司）、福林酚試劑（源葉生物公司）、無水乙醇、無水碳酸鈉、乙腈、甲醇、甲酸、醋酸銨，均為國產分析純。

儀器包括超低溫冰箱、超高效液相系統（Vanquish，Thermo，USA）、高分辨質譜檢測系統（Q exactive，Thermo）、UV-5500 型紫外可見分光光度計、高速離心機、恒溫烘干箱。

1.3 測定方法

1.3.1 柿葉單寧的提取及測定

參照韓衛娟等[5]和于曉銳等[8]的提取方法，略作修改，具體如下：稱取0.200 0 g 樣品，用10 mL、60%乙醇在超聲波清洗儀中恒溫60 ℃萃取40 min，定容至25 mL，離心取上清液待測。以牛廣財等[9]福林-酚比色法測定，略作修改，利用飽和碳酸鈉溶液提供穩定的堿性環境、靜置顯色反應時間為2 h。以沒食子酸標準品繪制標準曲線，并進行樣品測定。

柿單寧含量為：

式（1）中：x為利用標準曲線計算所得到的濃度，mg/mL；V為定容的容量，mL；N為稀釋倍數；m為樣品質量，g。

1.3.2 單寧清除DPPH 自由基能力的測定

采用DPPH 法測定[10]，用無水乙醇配制成質量濃度為0.065 mmol/L 的DPPH 溶液。將提取所得的柿葉單寧梯度稀釋為5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL、40 μg/mL、80 μg/mL，以相同濃度Vc 為對比。將待測液分別與DPPH 溶液避光反應30 min，在517 nm 處測定溶液的吸光度，并通過下式計算DPPH 自由基清除率。

抑制率計算如下：

式（2）中：Ac為乙醇代替樣品的吸光度；Ai為DPPH 加提取物吸光度；Aj為無水乙醇代替DPPH 溶液的吸光度。

1.3.3 單寧組分測定

1.3.3.1 樣本預處理

取200 mg 樣品，加入2M 鹽酸，80C 酸解3 h；取酸解液200 μL，旋轉濃縮干燥；加入1 mL 的50%甲醇溶液復溶；14 000 r/min 離心10 min，取上清液用C8 SPE 小柱純化。

1.3.3.2 色譜條件

色譜系統采用的是超高效液相系統，根據化合物的性質，采用Waters HSS T3（50×2.1 mm，1.8 μm）液相色譜柱，進樣量為2 μL，柱溫為40 ℃；流動相A（0.1%甲酸-乙腈），流動相B（0.1%甲酸-水）。流動相梯度如表1 所示。

表1 流動相梯度

1.3.3.3 質譜參數

鞘氣40，輔助氣10，離子噴霧電壓為2 800 V，溫度為350 ℃，離子傳輸管溫度為320 ℃。

1.3.4 保存條件對單寧含量的影響

采摘后將柿葉干燥處理，低溫組中，將葉片置于-80 ℃；干燥組中，將葉片置于干燥器中室溫避光保存，7 d 后按照1.3.3 的方法進行含量測定。

1.4 統計與分析

采用SPSS10.0 進行數據分析，采用Excel 2019 進行數據處理及制圖。

2 結果與分析

2.1 單寧標準曲線

沒食子酸標準曲線如圖1 所示，沒食子酸的質量濃度在0～0.10 mg/mL 內與A765吸光值呈良好的線性關系，在此范圍內的線性回歸方程為y=15.235x+0.0617，R2=0.998 3。

2.2 柿葉單寧含量動態變化

監測期內兩種柿葉動態變化規律大致相同，均呈現先下降后上升趨勢。兩種柿葉7 月份含量較低且穩定，隨后8 月份開始下降，此時果實處于幼果至膨大期，可溶性單寧會富集于果實中，8 月中旬含量出現最低點，9 月中下旬含量迅速上升。紅柿葉于10 月中旬含量達到最高后下降，黑柿葉9 月下旬出現快速富集，且持續上升，在落葉前含量未見下降，是潛在的優質資源。柿葉單寧含量的變化如圖2 所示。

圖1 沒食子酸標準曲線

圖2 柿葉單寧含量的變化

2.3 柿葉單寧的抗氧化性

DPPH 自由基是一種較穩定的自由基，常應用于抗氧化能力的測定。如圖3 所示，兩種柿葉醇提物對DPPH 氧化都具有抑制作用，且存在劑量效應。在相同濃度下，黑柿葉提取液抑制率較紅柿葉高。5 μg/mL 黑柿葉提取物對DPPH 自由基清除率為42.17%，同濃度Vc 對DPPH 自由基清除率為24.09%，與紅柿葉提取物清除率相近。20 μg/mL 濃度下三者對DPPH 自由基都有較好的清除效果，高于20 μg/mL 后Vc 的清除效果最好。黑柿葉單寧提取物、紅柿單寧提取物和抗壞血酸的IC50分別為6.33 μg/mL、11.16 μg/mL 和11.40 μg/mL，因此，黑柿葉提取物有較好的抗氧化能力。柿葉單寧對DPPH 清除能力如圖3 所示。

圖3 柿葉單寧對DPPH 清除能力

2.4 柿葉單寧組分分析

由圖3 可知，柿葉中檢測出8 種單寧組分，分別是沒食子兒茶素（Gallocatechin，GC）、表沒食子兒茶素（Epigallocatechin，EGC）、兒茶素（Catechin，CA）、表兒茶素（(Epicatechin，EC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（Gallocatechin gallate，GCG）、表兒茶素沒食子酸酯（Epicatechin gallate，ECG）和鞣花酸（Ellagic acid），其中GC 和CA 含量最多，尤其是常溫貯藏7 d 的黑柿葉其中GC 含量（23.43 ng/mg）是紅柿葉的（3.1 ng/mg）7 倍多，CA 含量達到了37.65 ng/mg 是紅柿葉的5 倍多。通過貯存試驗發現，無論常溫還是低溫，7 d 后GC、EGC、CA、EC 出現含量上升的現象，常溫貯藏條件更利于黑柿葉中成分富集，而低溫利于紅柿葉；有研究表明水不溶性酚類物質在貯藏期間可轉化為可溶性物質，部分酚類物質的氧化中間產物也可能被還原[11]，導致含量升高，但是具體原因還需要進一步研究。EGCG、GCG、ECG 和鞣花酸含量在貯藏過程中降低。此外柿葉中槲皮素-3-O-呋喃葡萄糖苷和槲皮素兩種黃酮類物質含量非常豐富，烘干的紅柿葉中槲皮素-3-O-呋喃葡萄糖苷含量可達到230.73 ng/mg，槲皮素含量為278.23 ng/mg，烘干的黑柿葉中槲皮素-3-O-呋喃葡萄糖苷含量為151.53 ng/mg，槲皮素含量為124.02 ng/mg。但是黑柿葉中蘆丁和芹菜素含量非常少，因此，成分的測定可為開發柿葉新功能奠定基礎。

黑柿葉中單寧組分的變化如圖4 所示。紅柿葉中單寧組分的變化如圖5 所示。

圖4 黑柿葉中單寧組分的變化

圖5 紅柿葉中單寧組分的變化

3 討論與結論

柿葉中含有黃酮甙類、二萜類、茶多酚、橙皮甙等活性物質[12]，本試驗利用超聲波輔助提取法對柿葉中的單寧進行提取，結果表明，柿葉中單寧的積累隨著生長發育時期的不同而變化，且具有一定的規律性。富有甜柿和黑柿葉中單寧含量動態變化規律大致相同，均呈現先下降后上升趨勢。7月份含量較低且穩定，隨后8 月中旬含量下降出現最低點，這可能是果實的生長和其中單寧富集有關，9 月中下旬迅速回升此時果實逐漸成熟。富有甜柿葉在10 月中旬達到最高峰，而黑柿葉自9 月下旬至落葉前一直呈增長趨勢，尤其是落果后黑柿葉中單寧含量豐富，可作為單寧提取的資源，既可避免資源浪費，又可提高經濟效益。柿果中單寧含量在7—8 月達到峰值，與柿葉單寧出現錯峰，即葉片中含量自幼果期緩慢下降后，成熟后期迅速升高，但是關于柿果與葉片中單寧成分和含量是否存在相關性尚需進一步研究。

該研究對兩種柿葉中單寧的抗氧化活性進行探究，在設定的濃度范圍內，單寧與DPPH 清除率呈現劑量關系，較低的值表明更高的自由基清除能力，IC50說明黑柿葉提取物是一種較好的抗氧化物質。

分析兩種柿子葉成分得知，黑柿葉和紅柿葉中單寧的存在形式和含量并不一致。其中GC 和CA 含量在單寧物質中最豐富，黑柿葉中這兩種成分含量都高于紅柿葉，貯藏7 d后含量還會升高。同時柿葉中還含有槲皮素及其衍生物等多種黃酮類物質。中國柿品種豐富，資源開發利用潛力巨大，今后應在開發、推廣新資源的基礎上深入研究有效成分及生物生產特性，為柿資源的進一步深加工和利用奠定基礎。