實時直接分析-四極桿飛行時間質譜法快速鑒別油茶籽油真偽

胡 謙，張九凱，邢冉冉，陳 穎

(1.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176；2.北京工商大學 食品與健康學院，北京 100048)

油茶籽油是油茶樹種子經壓榨或浸出的世界四大木本植物油之一，油茶樹在我國有悠久的栽培和利用歷史。油茶籽油的脂肪酸組成比例和理化性質與橄欖油非常相似，而且油酸的含量高于橄欖油，棕櫚酸和硬脂酸的含量低于橄欖油[1]，被譽為“東方橄欖油”。油茶籽油易于被人體消化吸收，具有多種生物活性成分，有益于人體健康[2-3]，其價格一般是普通食用油的3～5倍，由于國內油茶籽油市場的消費量日漸增多以及原料產量和成本的限制等原因，受利益驅使的不法廠商往往會向油茶籽油中摻雜廉價食用油以獲取暴利。為了打擊油茶籽油的摻假使假，維護消費者的合法權益，維護油茶籽油產業的健康發展，為行政執法提供依據，研究油茶籽油的真偽鑒別方法具有重要意義。

目前，油茶籽油的真偽鑒別技術主要有光譜法[4-5]、氣相色譜-質譜聯用法[6-7]、液相色譜-質譜聯用法[8]等。光譜技術具有快速、無損的優點，通常結合化學計量學建立判別模型以鑒別食用油的真偽，但該技術難以篩選食用油的特征標志物。氣相色譜以及氣相色譜-質譜聯用技術檢測的化合物多為脂肪酸和甾醇，且需復雜的衍生化步驟，然而食用油主要由甘油三酯(95%～98%)組成[9]，脂肪酸輪廓僅反映了食用油組成的一部分。氣相色譜-質譜聯用技術雖也被用于分析食用油的揮發性成分，實現對食用油的真偽鑒別[10]，但食用油的加工工藝和產地會對揮發性組分造成非常大的影響[11-12]，因此該方法的可重復性和適用性還需進一步探究。液相色譜-質譜聯用技術具有特異性強、靈敏度高的特點，通常用于分析食用油中的甘油三酯、酚類和生育酚等物質，許多研究表明這些化合物可作為食用油真偽鑒別的潛在標志物[13]，但其前處理復雜，分析時間過長，且需消耗大量的有機試劑。

快速發展的敞開式電離質譜技術可在常壓敞開環境中直接對樣品解吸電離，獲得樣品組分的輪廓信息[14]，已廣泛用于食品品質分析[15-16]、食品真偽鑒別[17-18]、非法添加物檢測[19]和司法鑒定[20]等領域。目前已經發展出幾十種敞開式電離技術，包括實時直接分析(Direct analysis in real time，DART)、解吸電噴霧電離(Desorption electrospray ionization，DESI)和萃取電噴霧電離(Extractive electrospray ionization，EESI)等[21]。其中DART是一種兩步電離技術，在常壓條件下利用高壓放電將基態的氦氣變為激發態，并在陶瓷加熱管加熱作用下提高動能，將樣品組分熱脫附，然后通過潘寧電離和氣態的質子/電子將樣品組分離子化[22]。相比于色譜-質譜聯用技術，DART-MS無需或只需極少的樣品前處理，即可快速、高通量地分析獲得樣品的代謝物輪廓信息。另外，相比于基于電噴霧電離的敞開式離子化技術，DART對中低極性化合物具有很強的檢測能力。因此，DART非常適用于快速分析主要由低極性甘油三酯組成的食用油。基于此，本研究采用DART-QTOF-MS技術實現了油茶籽油的快速鑒別。首先對食用油處理方法和氦氣溫度進行優化，以獲得更多的代謝物輪廓信息，并解析了油茶籽油、菜籽油、花生油和大豆油的高分辨質譜圖中甘油酯離子和源內碎片離子，然后采用化學計量學建立了判別模型，對油茶籽油、菜籽油、花生油和大豆油進行預測。

1 實驗部分

1.1 樣品、試劑與儀器

20份油茶籽油均由贛州市產品質量監督檢驗所提供，其中江西省10份，福建省、廣東省、廣西省和云南省各2份，湖北省和安徽省各1份。菜籽油、花生油和大豆油各8份，由江南大學收集于各油脂加工企業。甲醇和異丙醇購自德國CNW公司，乙酸銨購自美國Sigma-Aldrich公司，均為LC-MS級。DART-QTOF-MS系統由配備12 Dip-It tip模塊的DART-SVP離子源(美國IonSense公司)串聯TripleTOF 6600質譜(美國SCIEX公司)組成；全石英玻璃棒(北京華質泰科公司)。

1.2 樣品處理

稱取10 mg(精確至0.1 mg)食用油樣品，加10 mL甲醇-異丙醇(體積比50∶50，含5 mmol/L乙酸銨)稀釋后，用移液器吸取1 μL滴于全石英玻璃棒上，待有機試劑揮發后進DART-QTOF-MS檢測，每份食用油平行3份。

1.3 檢測條件

DART離子源參數：DART離子源與Vapur接口的陶瓷管距離為10 mm，Vapur接口的陶瓷管與加熱毛細管距離為2 mm;離子化設置為正離子模式，工作氣體為氦氣，待機氣體為氮氣;載氣溫度為450 ℃;12 Dip-It tip模塊在氦氣下的移動速度為0.6 mm/s;柵極電極為+350 V。

質譜參數：TripleTOF 6600 MS檢測離子源接口為NanoSpray離子源；DART-QTOF-MS分析時霧化氣和輔助加熱氣被禁用，氣簾氣壓力10 psi(69 kPa)。TripleTOF 6600 MS采用TOF MS方法和信息依賴分析(Information dependent acquisition，IDA)方法分別獲得脂質的MS和MS/MS譜圖。全掃描TOF MS中，滯留時間為200 ms，正離子模式，掃描質量范圍為m/z100～1 100。MS/MS模式下，碰撞能量(CE)：35 eV；擴展碰撞能量(CES)：15 eV；滯留時間：50 ms；掃描質量范圍：m/z50～1 100。數據采集過程中定期采集氦氣流下背景空氣的質譜信號，用于評估并校正質譜的質量準確度，此方法僅使用了背景離子信號，無需額外內標化合物[23-24]。

1.4 化學計量學分析

使用MarkerView 1.3.1(美國SCIEX)軟件提取質譜峰，去除同位素組數據，獲得正離子數據矩陣，包括144個樣品(48個食用油樣品，重復分析3次)中離子的m/z值及其對應豐度。然后將每個食用油樣品的3次重復分析的峰強度取平均值，將數據導入SIMCA 15.0(瑞典Umetrics公司)軟件進行化學計量學分析，比較不同食用油樣本的聚集和離散趨勢。

2 結果與討論

2.1 樣品前處理條件的優化

DART離子源的離子化效率受樣品處理方式的影響，因此實驗比較了食用油原液和2種稀釋處理方式的質譜響應強度和離子豐度，以獲得盡可能多的組分信息。考慮到DART離子源具有快速、原位直接電離的優點，首先直接分析了油茶籽油原液的質譜響應強度和離子豐度，結果發現食用油的主要成分甘油三酯的離子化效率普遍較低。如圖1A中m/z902.813 0是由三油酸甘油酯(油茶籽油中最主要的甘油三酯)產生，其響應強度明顯低于DART源內碎片離子(m/z339.288 7)。因此，直接分析食用油原液的離子化效率不能滿足檢測需要，難以獲得豐富的食用油組分信息。Vaclavik等[25]也發現類似現象，這可能是由于食用油的黏度太高而影響了甘油酯的解吸。

圖1 油茶籽油不同處理方式正離子模式的DART-QTOF-MS質譜圖Fig.1 DART-QTOF-MS spectra of camellia oil under different pretreated positive ion modes A.edible oil stock;B.methanol-isopropanol(50∶50,by volume) dilution;C.methanol-isopropanol(50∶50,by volume,contain 5 mmol/L ammonium acetate) dilution

由于食用油基質復雜，需適當進行樣品前處理以降低基質效應，增強離子化效率，從而獲得更多食用油組分輪廓的信息。實驗比較了直接分析油茶籽油原液、甲醇-異丙醇(體積比50∶50)稀釋和甲醇-異丙醇(體積比50∶50，含5 mmol/L乙酸銨)稀釋3種處理方法對結果的影響。結果表明，采用甲醇-異丙醇(體積比50∶50)稀釋時甘油酯以[M+NH4]+的形式離子化，與直接分析食用油原液相比，稀釋極大地改善了甘油酯的離子化(圖1B)。而采用甲醇-異丙醇(體積比50∶50，含5 mmol/L乙酸銨)稀釋時，可使甘油酯分子穩定地產生氨加合離子，并顯著增強了質譜信號(圖1C)。有研究發現[26]，將25%的氨水溶液置于DART離子源附近，可以利用揮發到空氣中的氨來增強甘油酯離子化以產生[M+NH4]+。因此，甲醇-異丙醇(50∶50,含5 mmol/L乙酸銨)稀釋為最佳食用油前處理方式。

2.2 高分辨質譜分析

采用DART-QTOF-MS技術分析經甲醇-異丙醇(50∶50,含5 mmol/L乙酸銨)稀釋的食用油樣品，可檢出大量甘油三酯(TAG)和甘油二酯(DAG)的氨加合離子[M+NH4]+和質子化離子[M+H]+，且[M+NH4]+的質譜響應更強。此外,TAG還會在DART離子源內裂解產生甘油二酯碎片離子[TAG+H-RCOOH]+、甘油一酯碎片離子[TAG+H-RCOOH-RCO]+和酰基離子[RCO]+等碎片離子。以油茶籽油中最豐富的TAG 54∶3為例，其氨加合產生m/z902.817 1要比質子化產生的m/z885.790 6響應強度高約一個數量級，源內裂解產生的碎片離子依次為m/z603.534 7、339.289 4和265.253 1。這些DART離子源產生的離子及其碎片離子與之前的研究類似[25,27]。表1列出了在4種食用油中均檢出的20種TAG和6種DAG，其質量誤差均在±5 ppm以內。

表1 4種食用油中以[M+NH4]+鑒定的甘油酯Table 1 Glycerolipids identified by [M+NH4]+ in the four edible oils

在優化的樣品處理方式和DART離子源條件下，4種食用油(油茶籽油、菜籽油、花生油和大豆油)的甘油三酯氨加合離子[TAG+NH4]+主要集中在m/z850～1 100范圍內，6種DAG加合離子[DAG+NH4]+為m/z600～700，此外還檢出部分甘油酯的碎片離子。但由于不同食用油中甘油酯分子的組成和分布不同，4種食用油的DART-QTOF-MS存在明顯差異(圖2)。油茶籽油中最強離子為TAG 54∶3產生的m/z902.817 5，其次為由TAG 52∶2產生的m/z876.800 5(圖2A)。這與前期采用液相色譜-質譜聯用技術研究的結果相似，油茶籽油中含量最高的前2種甘油三酯為TAG 54∶3和TAG 52∶2，且TAG 54∶3的相對含量超過30%[28]。菜籽油的最強離子與油茶籽油相同，均為m/z902.817 6，但與油茶籽油不同的是，菜籽油中由TAG 54∶4產生的m/z900.801 2也具有很高的響應(圖2B)。Wei等[29]使用液相色譜-質譜聯用技術發現，菜籽油中三油酸甘油酯(TAG 54∶3)的相對豐度最高(達25.30%)，其次為二油酸亞油酸甘油酯(TAG 54∶4，相對豐度為21.21%)，與本研究結果相似。在花生油中，由甘油三酯氨加合生成的最強的兩個離子與菜籽油相同，但花生油和菜籽油之間整體離子強度存在差異(圖2C)。與油茶籽油、菜籽油和花生油均不同的是，大豆油中由甘油酯生成的最強2個離子為m/z896.768 8和m/z898.783 0(圖2D)，分別對應TAG 54∶4和TAG 54∶5，這與Wei等[29]的研究結果類似。

圖2 甲醇-異丙醇(體積比50∶50，5 mmol/L乙酸銨)稀釋4種食用油的DART-QTOF-MS質譜圖Fig.2 DART-QTOF-MS spectra of four edible oils diluted with methanol-isopropanol(50∶50,5 mmol/L ammonium acetate)A.camellia oil;B.rapeseed oil;C.peanut oil;D.soybean oil

圖3 DART-QTOF-MS分析食用油的PCA得分散點圖Fig.3 Score scatter plot of PCA of edible oil analyzed by DART-QTOF-MS

2.3 化學計量學分析

為使DART-QTOF-MS分析獲得的4種食用油的多維輪廓信息能實現數據可視化，本研究進一步采用化學計量學分析以解釋復雜的數據。采用Markerview軟件提取出3 696個離子峰，再經Pareto縮放的無監督主成分分析(Principal component analysis，PCA)方法將數據降維，分析不同組樣本的離散和聚集趨勢。以20個油茶籽油、8個菜籽油、8個花生油和8個大豆油的數據建立PCA模型，結果發現前5個主成分總貢獻為71.3%，其中第一主成分(PC1)貢獻為37.0%，第二主成分(PC2)貢獻為11.6%。所有樣本均在98%的置信區間內，未觀察到異常樣本。PCA得分圖(圖3)顯示油茶籽油主要集中于第一和第四象限，在第一主成分上可以區分油茶籽油與菜籽油、花生油和大豆油，但菜籽油和花生油在PCA得分圖上出現重疊。DART-QTOF-MS質譜也顯示，菜籽油和花生油較為類似(圖2B、C)，而PCA是一種無監督的模型，可能導致了菜籽油和花生油的重疊。

為減少組內隨機誤差，突出組間輪廓差異，彌補無監督模型的缺陷，采用有監督的正交偏最小二乘法-判別分析(Orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA)建立判別模型，并對預測集進行預測。4種食用油樣本分別隨機選取3/4的樣本作為訓練集以建立判別模型，剩余樣本作為預測集以評估判別模型的預測能力。結果顯示，OPLS-DA模型的R2X、R2Y和Q2分別為0.754、0.979和0.906，表明模型具有較好的解釋和預測能力，且油茶籽油、菜籽油、花生油和大豆油被明顯區分(圖4A)。為進一步評估OPLS-DA模型準確預測未知樣本的能力，將預測集導入OPLS-DA模型。圖4B為OPLS-DA模型的預測得分散點圖，圖中可見每種食用油的預測集(無填充)與相應的訓練集(有填充)均準確聚類在一起，說明OPLS-DA模型可準確預測未知樣本。但本研究未分析不同摻雜比例的油茶籽油樣本，后續研究將擴大代表性的油茶籽油樣本，以及其它食用油的種類和數量，以建立更準確、穩定和可靠的食用油種類預測模型和摻雜定量預測模型。

3 結 論

本研究基于DART-QTOF-MS技術開發了一種快速鑒別油茶籽油的方法。在高分辨質譜圖中初步鑒定出20種甘油三酯和6種甘油二酯。進一步采用PCA模型觀察樣本之間的聚集和離散程度，但不能區分油茶籽油、菜籽油、花生油和大豆油。而OPLS-DA模型具有較好的解釋和預測能力，可以準確區分并預測油茶籽油、菜籽油、花生油和大豆油。研究表明，該方法無需復雜、耗時的色譜分離，適用于快速鑒別油茶籽油。