實(shí)時(shí)直接分析質(zhì)譜分析中草藥多糖

蔣 青，李紅麗

(南京師范大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，生物醫(yī)學(xué)功能材料江蘇協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇生物醫(yī)學(xué)材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023)

多糖成分廣泛存在于多種食物和傳統(tǒng)草藥中，是重要的營養(yǎng)補(bǔ)充劑[1]。據(jù)報(bào)道，中草藥多糖具有抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、消炎、調(diào)節(jié)血糖等多種功效[2-4]，近幾十年來，多糖產(chǎn)品越來越受到人們的重視。由于受種類、產(chǎn)地、種植條件和加工方法等因素影響，多糖的品質(zhì)有較大差異，但目前尚無有效的方法來評價(jià)、鑒別和鑒定多糖成分和產(chǎn)品的差異。開發(fā)新的分析方法以產(chǎn)生有價(jià)值的指紋圖譜，對于多糖的質(zhì)量評估和探索多糖之間的差異至關(guān)重要[5-6]。

目前對于中草藥多糖的研究主要涉及樣品制備、完整多糖分離和水解物的分析等[7]。從植物中提取生物活性多糖的常用方法有熱水提取、微波輔助提取和超聲波輔助提取[8-10]。但這些方法通常步驟繁瑣，并且采用高溫或高輻射，處理時(shí)間長。最近，一種新型的機(jī)械力化學(xué)提取(Mechanochemical extraction,MCE)法[11]被成功應(yīng)用于天然產(chǎn)物的提取。MCE利用小陶瓷球提供的高速機(jī)械振動(dòng)和旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)使植物細(xì)胞破裂，并迅速將活性成分釋放到溶劑中，可大大縮短提取時(shí)間，提高提取效率。

多糖是一類結(jié)構(gòu)極其復(fù)雜的高分子聚合物，分子量從幾十到幾千kDa不等。由于存在組成的單體(單糖)、寡糖的結(jié)構(gòu)，糖鏈聚集和空間構(gòu)象等方面的差異，多糖的研究對分析技術(shù)提出了很大的挑戰(zhàn)[12-13]。多糖的分析方法有紅外光譜(IR)[14]、紫外光譜(UV)[15]、X射線衍射(XRD)[16]、核磁共振(NMR)[17]、液相色譜(LC)[18]和質(zhì)譜(MS)[19]等技術(shù)。進(jìn)行多糖分析時(shí)通常需將其水解，使大分子的多糖通過化學(xué)或酶解完全或部分水解成單糖和寡糖，隨后使用液相色譜(LC)或液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)進(jìn)行分析[20-21]。但多糖水解物(單糖、寡糖或低聚糖)的LC或LC-MS指紋分析一般需要很長時(shí)間的樣品水解或/和衍生化步驟，以及繁瑣的LC分析程序。實(shí)時(shí)直接分析質(zhì)譜(Direct analysis in real time mass spectrometry,DART-MS)操作簡單、分析速度快(幾秒)、對樣品預(yù)處理要求低，是近年來發(fā)展起來的原位電離質(zhì)譜技術(shù)之一[22-23]，在食品、環(huán)境中有毒有害物及藥物的高通量和快速篩查中表現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢[24-26]，但其在大分子聚合物領(lǐng)域的研究較少。DART離子源能夠?qū)⑼暾亩嗵撬查g分解成小碎片，為高通量、直接、快速評價(jià)多糖提供了新方法[27]。

本研究采用機(jī)械力化學(xué)提取法，從傳統(tǒng)藥材銀耳、黨參、黃芪、百合、茯苓、鐵皮石斛、金釵石斛和鼓槌石斛中高效提取多糖成分；聯(lián)用DART和高分辨質(zhì)譜(HRMS)直接分析了其中的多糖大分子，建立了上述8種中草藥中多糖的快速指紋分析方法，并結(jié)合多變量數(shù)據(jù)分析進(jìn)一步表征了多糖間的差異。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑、儀器與樣品

葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品(分子量分別為1、5、25、80、270、670、3 755 kDa)購自美國Sigma Aldrich 公司。乙醇、三氯甲烷、丁醇等溶劑均由上海華藥化學(xué)試劑有限公司提供。實(shí)驗(yàn)用水均采用娃哈哈純化水(娃哈哈集團(tuán)有限公司，南京)。

Orbitrap Fusion Lumos高分辨質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher Scientific)，配有DART-SVP(Ion Sense Inc.,Saugus,MA,美國)離子源；DIP-it tip 玻璃毛細(xì)管、DIP-it支架(美國Ion Sense Inc公司)，DART系統(tǒng)由在線軟件(5.0.5版)控制。所用工作氣體為氦氣(長城特種氣體公司(無錫))，純度為99.999%。FW-100粉碎機(jī)(天津泰斯特公司)，80目篩網(wǎng)(南京雄辰公司)，3 kDa超濾膜(南京福邁斯生物技術(shù)有限公司)，體積排阻色譜分析采用Ultimate 3000 超高效液相色譜(UPLC)系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific)和示差檢測器(ERC RefractoMax520,DataApex Ltd.,Prague,Czech Republic)，PolySep-GFC-P線性柱(300 mm×7.8 mm,分子量范圍≤107Dalton,Phenomenex,Torrance,CA,USA)。

銀耳(Tremellafuciformi,TF)和黨參(Codonopsispilosula,CP)的干燥莖分別購自山東省、湖北省的市場；黃芪片(Astragalusmembranaceus,AM)和百合(Liliumbrownii,LB)采集于北京同仁堂有限公司(中國福州)；茯苓(Poriacocos,PC)多糖口服液采購于湖南省；鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale,DO)、金釵石斛(Dendrobiumnobile,DN )和鼓槌石斛(Dendrobiumchrysotoxum,DC)分別產(chǎn)自浙江、廣西和云南。

1.2 樣品制備

首先將干燥的樣品(莖或片)粉碎，然后進(jìn)行篩分制成細(xì)粉。利用MCE從粉末樣品中提取多糖成分，得到多糖粗提液。多糖粗提液經(jīng)醇沉、sevage法除蛋白純化后，凍干得到干燥樣品。所有多糖樣品均經(jīng)3 kDa超濾膜過濾除去3 000 Da分子量以下的雜質(zhì)和物質(zhì)。所有多糖純化樣品均用純化水配制成2.0 mg·mL-1的溶液，供色譜和質(zhì)譜分析。

1.3 體積排阻色譜分析

進(jìn)行體積排阻色譜分析時(shí)，示差檢測器的溫度設(shè)置為32 ℃。注入10 μL的多糖溶液(2.0 mg·mL-1)，以0.8 mL·min-1的流速將純化水作為流動(dòng)相。在相同實(shí)驗(yàn)條件下，根據(jù)葡聚糖(2.0 mg·mL-1)的校準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖的分子量(Molecular weight,MW)，每個(gè)樣品進(jìn)行多次重復(fù)分析(n≥3)。

1.4 DART-MS分析

在進(jìn)行DART-MS分析時(shí)，將1 μL液體樣品滴至DIP-it tip玻璃毛細(xì)管底部，樣品由12個(gè)DIP-it支架在移動(dòng)軌道上引入。網(wǎng)格電極電壓設(shè)定為350 V，DART工作氣體為氦氣。對線性軌道移動(dòng)速度和氣體溫度等參數(shù)進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化。質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置如下：軌道阱分辨率為60 000，最大進(jìn)樣時(shí)間為100 ms，自動(dòng)控制增益為 2×105，離子傳輸管溫度為350 ℃。在正離子模式下，全掃描收集圖譜，質(zhì)量范圍為m/z50～500。每個(gè)樣品進(jìn)行多次重復(fù)分析(n≥5)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用Chromeleon 7.2 SR4(Thermo Fisher Scientific)軟件收集原始體積排阻色譜數(shù)據(jù)，用Tune Plus采集質(zhì)譜數(shù)據(jù)，通過Xcalibur軟件(Thermo Fisher Scientific,Inc.)進(jìn)行分析。從Chromeleon 7.2 SR4和Xcalibur 2.1導(dǎo)出的原始數(shù)據(jù)用Origin 8.6(OriginLab,Northampton,MA,USA)處理，繪制最終圖譜。多糖的多變量數(shù)據(jù)分析采用MetaboAnalyst 4.0(https://www.metaboanalyst.ca/MetaboAnalyst/ModuleView.xhtml)。

2 結(jié)果與討論

2.1 多糖分子量的測定

用體積排阻色譜(Size exclusion chromatography,SEC)柱結(jié)合示差檢測器對多糖樣品的分子量進(jìn)行評估。圖1為本研究中所有多糖樣品的體積排阻色譜圖。多糖與具有固定分子量的小分子不同，是具有一定多分散性的高分子混合物，峰越窄，說明特定組分中多糖的大小越接近。不同類型多糖的SEC曲線是有區(qū)別的，具體而言，LB(7.99 min和9.62 min)提取的多糖出現(xiàn)兩個(gè)解析峰，而AM(6.94 min)、TF(7.58 min)、PC(8.32 min)、DC(9.38 min)、 DN(9.91 min)、DO(10.27 min)和CP(11.74 min)中的多糖主要出現(xiàn)一個(gè)寬峰。

葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的體積排阻色譜圖和校準(zhǔn)曲線見圖2，根據(jù)校準(zhǔn)曲線計(jì)算的多糖分子量列于表1。其中部分峰的洗脫時(shí)間早于葡聚糖3 755 kDa標(biāo)準(zhǔn)品的校準(zhǔn)范圍上限(Rt= 9.23 min)，則其相應(yīng)的MWs大于3 755 kDa。本研究中的多糖成分涵蓋了幾千到數(shù)百萬Da的分子量范圍，故從標(biāo)定曲線中得到的分子大小僅為估計(jì)值。此處的SEC分離主要顯示了不同種類的多糖成分之間存在差異。

表1 根據(jù)校準(zhǔn)曲線計(jì)算的多糖分子量Table 1 Estimated molecular weights of dominant SEC peaks of respective polysaccharide calculated based on the calibration curve

2.2 中藥植物多糖提取方法的比較

分別采用超聲法(40 min)和熱水提取法(烘箱60 ℃加熱80 min)對DO 和CP多糖進(jìn)行提取，并將提取結(jié)果與MCE法進(jìn)行比較。由圖3可知，兩種中草藥植物多糖在MCE提取下，經(jīng)DART-MS檢測到的主要碎片離子峰的峰面積高于或與傳統(tǒng)方法相當(dāng)，提取時(shí)間(60 s)短，綜合表現(xiàn)出較高的提取效率。從節(jié)能環(huán)保、操作簡便、高效的角度考慮，MCE法優(yōu)于其它提取方法。

考察了MCE法中提取時(shí)間(s)、速度(m/s)和固液比(中草藥植物多糖粉末質(zhì)量與水的體積比，g·mL-1)對提取效率的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以上參數(shù)對提取效果的影響不大，最終選擇的條件為提取時(shí)間60 s，提取速率4 m/s，固液比0.1 g m·L-1。選取DO、 DN、 CP、AM 4種多糖樣品為代表進(jìn)行重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。各取經(jīng)MCE法提取的多糖粗溶液平行樣品3個(gè)，每個(gè)樣品進(jìn)行5次DART-MS檢測，得到相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n≥5)的范圍為1.3%～10%,與文獻(xiàn)報(bào)道的DART-MS的RSD基本一致[26]。

2.3 DART-MS參數(shù)的優(yōu)化

影響DART電離的關(guān)鍵儀器參數(shù)主要有氦氣溫度和線性軌道移動(dòng)速率。以DO 和CP 為樣品，考察了溫度(250、300 、350、400 ℃)和速率(0.3 、0.5、0.7 、1 mm/s)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著溫度升高，主要碎片離子的峰面積明顯提高，其中400 ℃表現(xiàn)最佳，這主要是因?yàn)楦邷赜欣谀繕?biāo)物的解析和電離。而線性軌道移動(dòng)速率在0.3 mm/s條件下獲得的信號強(qiáng)度最佳，可能是因?yàn)檩^慢的速度會使樣品和 DART 源之間的接觸時(shí)間更長，從而提高電離效率。

2.4 DART-MS直接分析中草藥多糖

采用DART-MS直接分析8種不同種類中草藥的多糖成分，結(jié)果見圖4。大分子多糖在DART離子源下幾秒鐘內(nèi)即可裂解成離子碎片，通過MS檢測，離子碎片的m/z<350(圖譜中只標(biāo)出了強(qiáng)度較高的離子)。目前一般的電離方法(如電噴霧電離(ESI)、基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI))對多糖的電離效果均不理想，質(zhì)譜直接電離和鑒定完整多糖非常困難。而多糖可在DART離子源中高溫裂解，轉(zhuǎn)化為小分子物質(zhì)，可使用DART-MS直接分析。

采用DART離子源分析時(shí)，不同植物種類的主要產(chǎn)物離子存在明顯差異。大部分中草藥提取的糖類在m/z100～200質(zhì)量范圍內(nèi)產(chǎn)生大量離子，而CP和PC在m/z300或350下也產(chǎn)生了較明顯的信號。不同類型的多糖都產(chǎn)生了獨(dú)特的指紋碎片，包括CP 的m/z342.14、325.11和271.08， TF 的m/z112.05、115.04、136.06和 268.10， PC的m/z173.08、220.08和238.09，AM的m/z112.09、116.07和177.10，而DC(圖4B)、LB(圖4C)、DO(圖4E)和DN(圖4G)的主要碎片離子相似，包括m/z127.04、145.05、187.06和205.07。但是，這些相同的碎片離子的信號強(qiáng)度分布不同，離子質(zhì)譜圖也存在差別。例如，DN碎片m/z187.06的信號明顯高于其他石斛多糖。結(jié)果顯示，從不同藥材中提取的多糖呈現(xiàn)出具有特點(diǎn)的DART-MS指紋圖譜，這些標(biāo)記或特征離子可用于快速區(qū)分和識別中草藥類別。同時(shí)利用精準(zhǔn)質(zhì)量可以推斷標(biāo)記或特征離子的分子式，質(zhì)量誤差基本小于10 ppm。主要離子峰的詳細(xì)解析參考作者的前期研究[27]。

圖4 DART-MS檢測8種中草藥多糖粗提液的指紋圖譜Fig.4 DART-MS analysis of supernatant extracts of 8 traditional Chinese medicine polysaccharides

此外，以DO、CP、DN、TF 4種多糖為目標(biāo)分析物，分別在相同的MCE提取條件下，得到兩組平行樣品。一組進(jìn)行醇沉、去蛋白等步驟得到多糖純化樣品，另一組加入溶劑水得到多糖粗溶液的稀釋液。將兩組樣品在相同條件下進(jìn)行DART-MS分析檢測，結(jié)果顯示(圖4)，DART-MS檢測多糖純化樣品(紅色)和多糖粗溶液稀釋樣品(黑色)的質(zhì)譜圖幾乎完全重疊，無明顯差異。而直接檢測多糖粗溶液，可顯著縮短多糖樣品的制備時(shí)間，提高分析效率。以上結(jié)果說明快速的MCE法結(jié)合實(shí)時(shí)直接分析質(zhì)譜DART-MS可實(shí)現(xiàn)中草藥多糖的高效指紋分析。另外，部分多糖產(chǎn)生的碎片離子與單糖和寡糖標(biāo)準(zhǔn)品在DART-MS上的信號一致，但目前并未發(fā)現(xiàn)多糖與已試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)品的直接關(guān)聯(lián)，其原因尚有待于進(jìn)一步探索。

2.5 多維數(shù)據(jù)分析

進(jìn)一步對DART-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行了主成分分析(PCA)，圖5為不同種類的中草藥多糖(AM、DN、DC、DO、LB、TF、PC和CP)的二維和三維PCA圖，每種樣品使用6個(gè)DART-MS重復(fù)數(shù)據(jù)。從圖5可以看出，每個(gè)樣品都形成了獨(dú)立的數(shù)據(jù)簇，其中CP、 TF、 AM、 LB、 PC 和DN 表現(xiàn)出良好的區(qū)分度。DO和 DC 在圖中相近，可能是由于它們都屬于石斛類種屬，產(chǎn)生的碎片相似。主成分分析結(jié)果與上文的DART-MS圖譜結(jié)果基本一致，進(jìn)一步說明DART-MS可用于中草藥多糖的快速區(qū)分。

圖5 通過主成分分析(PCA)對不同種類多糖的6組重復(fù)DART-MS數(shù)據(jù)進(jìn)行快速區(qū)分Fig.5 Rapid differentiation of different kinds of polysaccharides by unsupervised principal component analysis(PCA) of DART-MS data of six replicatesA.two-dimensional PCA analysis，B.three-dimensional PCA analysis

3 結(jié) 論

通過對多種中草藥中多糖的研究，證明大分子糖類在DART離子源中幾秒內(nèi)即可直接被裂解并電離，且不同品種的多糖表現(xiàn)出特征性的碎片離子。MCE 與DART-MS分析相結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)多糖大分子的快速、簡單、靈敏、高通量檢測，提供了直接、高效評估結(jié)構(gòu)復(fù)雜的植物多糖大分子的新方法，避免了繁瑣耗時(shí)的樣品前處理過程，改變了傳統(tǒng)的分析程序。多變量數(shù)據(jù)分析進(jìn)一步驗(yàn)證了DART-MS可用于快速區(qū)分植物多糖。DART-MS方法在多糖的質(zhì)量評估中有良好的應(yīng)用潛力。