半枝蓮氯仿極性部位提取物調控linc01843逆轉大腸癌5-FU耐藥研究

張 鈴 方 翌 林久茂 蔡巧燕 魏麗慧 熊曉滿 劉 菲 鄭小紅 俞詩雅 林燕濱

（1.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州 350122；2.福建省中西醫結合老年性疾病重點實驗室，福建 福州 350122；3.福建中醫藥大學中西醫結合學院，福建 福州 350122）

大腸癌是一種常見的惡性腫瘤，其病死率位居全球第二［1］。 在過去的 50 年，5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）是治療大腸癌最常用的藥物。然而，患者對5-FU產生耐藥在很大程度上限制了其治療的有效性［2］。因此，探討大腸癌對5-FU產生耐藥的潛在分子機制，并探索5-FU耐藥的新診斷生物標記物已迫在眉睫。長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類長度大于 200 bp的非編碼RNA，具有5’帽子和 poly尾巴，通過剪接形成成熟的lncRNA，不具有或很少具有編碼蛋白的功能。目前研究已發現，lncRNA具有數量多、類型多、功能多等特點，它們參與了調控基因表達的各個階段，包括染色質重塑、基因轉錄、轉錄后調節、蛋白質翻譯以及翻譯后的調控［3］，而許多lncRNA已被證實在腫瘤的耐藥中起到了重要的調控作用［4］。目前的最新研究顯示，中藥能夠通過調控lncRNA逆轉腫瘤耐藥［5］。半枝蓮具有清熱解毒、利尿散瘀等功效，在臨床上常單用或聯合應用于治療各種腫瘤，包括肺癌、乳腺癌和大腸癌等，并且取得較好的療效［6］。本課題組前期研究表明半枝蓮通過“多環節、多途徑、多靶點”方式起到抗大腸癌的作用［7-11］。同時，半枝蓮氯仿極性部位提取物（ECSB）是逆轉大腸癌5-FU耐藥最有效的部位提取物［12］，且作用機制可能與下調LRP基因有關［13］。但半枝蓮能否通過調控lncRNA的表達逆轉大腸癌對5-FU的耐藥，仍需進一步研究。因此，本實驗初步研究linc01843與5-FU耐藥的相關性，并進一步研究半枝蓮對其的調控作用。

1 實驗材料

1.1 實驗細胞與藥物 半枝蓮購于福建中醫藥大學國醫堂。人結腸癌細胞株HCT-8和耐5-FU細胞株HCT-8／5-FU均購于南京凱基生物科技發展有限公司。

1.2 實驗試劑 RPMI-1640培養基、胎牛血清、胰蛋白 酶 、Trizol、lipofectamine 3000、Opti-MEN 培 養基［美國賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；引物合成于上海生物工程有限公司；si-linc01843合成于上海吉瑪制藥技術有限公司；HiScript II 1st Strand cDNA合成試劑盒以及ChamQTM SYBR qPCR預混液（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTT，北京索萊寶科技有限公司）。

1.3 實驗儀器 二氧化碳培養箱（Heal Force公司）；超凈工作臺（蘇州凈化設備公司）；倒置顯微鏡系統（德國徠卡儀器有限公司）；多功能酶標［美國賽默飛世爾科技（中國）有限公司］；PCR擴增儀（美國伯樂公司）。

2 實驗方法

2.1 半枝蓮提取物的制備 用5 000 mL的85%乙醇將半枝蓮（500 g）回流提取3次并過濾。用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇溶劑進行萃取，得到半枝蓮的石油醚（EPESB）、氯仿（ECSB）、乙酸乙酯（EEASB）、正丁醇（ENBSB）的極性部位提取物。然后將這些提取物在旋轉蒸發儀上蒸發，得到的浸膏用二甲亞砜（DMSO）超聲溶解。其中，ECSB的終濃度為 200 mg／mL，并在-20℃儲存。

2.2 HCT-8和HCT-8／5-FU細胞培養 親本HCT-8細胞和5-FU耐藥HCT-8／5-FU細胞均在RPMI-1640培養基中培養（含10%胎牛血清，100 U／mL青霉素和 100 μg／mL 鏈霉素），置于 37 ℃、5%CO2的培養箱中進行傳代培養。HCT-8／5-FU細胞在上述培養條件下，同時在培養基中添加了15 μg／mL的5-FU，以維持其耐藥性。

2.3 RT-PCR法檢測HCT-8和HCT-8／5-FU細胞中 linc01843的表達 將 HCT-8和 HCT-8／5-FU細胞按2×105個／孔的密度接種于6孔板中，待細胞貼壁后，分別加入 5-FU（HCT-8：0、400 μmonl／L 5-FU；HCT-8／5-FU：0、3 200 μmonl／L 5-FU）干預48 h。48 h后，使用Trizol試劑提取總RNA。利用HiScript II 1st Strand cDNA合成試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA；用 ChamQTM SYBR qPCR預混液以及linc01843的引物，從cDNA中擴增出linc01843，將GAPDH作為內參。相對linc01843的RNA表達分析使用 2-ΔΔCt方法。

2.4 轉染 linc01843到 HCT-8和 HCT-8／5-FU細胞中 分別用Opti-MEN培養基配置si-linc01843、negative control（陰性對照）和 lipofectamine 3000 試劑液，且si-linc01843和negative control的終濃度為30 nmol／L，室溫靜止 5 min。 將配置好 si-linc01843、negative control與lipofectamine 3000試劑液等體積混合，室溫靜止15 min后加入到親本HCT-8細胞和5-FU耐藥HCT-8／5-FU細胞中。6 h后，去掉上清液，加入RPMI-1640完全培養基，進行后續實驗。

2.5 RT-PCR法檢測轉染si-linc01843后的HCT-8和HCT-8／5-FU細胞中linc01843的表達 將轉染 si-linc01843、negative control的 HCT-8 和 HCT-8／5-FU細胞培養48 h后，使用Trizol試劑提取總RNA。利用HiScript II 1st Strand cDNA合成試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA；用 ChamQTM SYBR qPCR預混液以及linc01843的引物，從cDNA中擴增出linc01843，將GAPDH作為內參。相對linc01843的RNA 表達分析使用 2-ΔΔCt方法。

2.6 MTT法檢測5-FU對轉染si-linc01843后的HCT-8和HCT-8／5-FU細胞活力的影響 取對數生長期細胞，將 HCT-8、HCT-8／5-FU細胞按1×104個／孔的密度接種于96孔板中，待細胞貼壁后，利用 lipofectamine 3000 將 si-linc01843、negative control轉染到細胞中，6 h后換液，分別加入不同劑量的 5-FU（HCT-8：0、200、400、800 μmonl／L 5-FU；HCT-8／5-FU：0、1 600、3 200、6 400 μmonl／L 5-FU），干預48 h后移去上清液，每孔加入0.5 mg／mL MTT溶液100 μL，37℃培養4 h。棄上清液后，每孔加入 100 μL DMSO，振蕩 10 min后，在 570 nm 處測OD值。

2.7 MTT法檢測ECSB及5-FU對HCT-8／5-FU細胞活力的影響 取對數生長期細胞，將HCT-8／5-FU細胞按1×104個／孔的密度接種于96孔板中，待細胞貼壁后，分別加入 ECSB（0、50、100、150、200、250 μg／mL）或 5-FU（0、400、800、1 600、3 200、6 400μmol／L）或 ECSB 聯合 5-FU（400、800、1 600、3 200、6 400 μmol／L 5-FU＋50 μg／mL ECSB；400、800、1 600、3 200、6 400 μmol／L 5-FU＋100 μg／mL ECSB）干預48 h，48 h后移去上清液，每孔加入 0.5 mg／mL MTT溶液100 μL，37℃培養4 h。棄上清液后，每孔加入100 μL DMSO，振蕩10 min后，在570 nm處測OD值。

2.8 RT-PCR法檢測ECSB對 HCT-8／5-FU細胞中linc01843表達的影響 將HCT-8／5-FU細胞按2×105個／孔的密度接種于6孔板中，待細胞貼壁后，分別加入 0、3 200 μmol／L 5-FU，3 200 μmol／L 5-FU＋50 μg／mL ECSB，3 200 μmol／L 5-FU＋100 μg／mL ECSB 干預 48 h，48 h 后收集各組細胞，使用Trizol試劑提取總RNA。利用HiScript II 1st Strand cDNA合成試劑盒將RNA逆轉錄成cDNA；用ChamQTM SYBR qPCR預混液以及linc01843的引物，從cDNA中擴增出linc01843，將GAPDH作為內參。相對linc01843的RNA表達分析使用2-ΔΔCt方法。

2.9 統計學方法 采用SPSS 16.0軟件進行處理。計量資料符合正態分布以（±s）表示，組間統計分析采用單因素方差分析。

3 結 果

3.1 linc01843在 HCT-8和 HCT-8／5-FU細胞中的表達 本研究發現：在5-FU干預下，HCT-8和HCT-8／5-FU細胞中的linc01843表達均顯著高于各自的對照組（見圖1），提示linc01843可能與大腸癌對5-FU的耐藥有關。

3.2 linc01843參與大腸癌5-FU的耐藥 在轉染了si-linc01843后，HCT-8和HCT-8／5-FU細胞中linc01843表達均顯著低于各自的negative control組（見圖2），說明轉染si-linc01843到兩株細胞中的模型構建成功，可進行后續實驗。表1和表2結果顯示：在沒有5-FU干預下，轉染了si-linc01843的HCT-8細胞和HCT-8／5-FU細胞活力已顯著低于其各自的negative control組，在相同5-FU劑量干預48 h下，轉染了si-linc01843組的兩株細胞活力仍均顯著低于各自的negative control組。這些實驗結果表明：linc01843參與了大腸癌5-FU的耐藥。

圖1 HCT-8和HCT-8／5-FU細胞在5-FU干預下的linc01843表達

圖2 HCT-8和HCT-8／5-FU細胞在轉染si-linc01843及negative control后的linc01843表達

表1 linc01843對HCT-8細胞活力的影響（±s）%

表1 linc01843對HCT-8細胞活力的影響（±s）%

注：與 0 μmol／L 5-FU 組比較，1） P＜0.05；與 negative control組比較，2） P＜0.05。

5-F U（μ m o l／L）0 2 0 0 4 0 0 8 0 0 n 6 6 6 6 n e g a t i v e c o n t r o l組1 0 0.0 0±4.4 3 6 4.5 9±3.3 5 1）6 0.2 2±2.8 5 1）5 8.7 9±3.1 2 1）s i-l i n c 0 1 8 4 3組7 8.5 9±2.4 6 2）5 4.9 2±4.8 0 2）5 3.1 9±2.2 0 2）4 6.5 0±2.4 1 2）

3.3 ECSB及5-FU對HCT-8／5-FU細胞活力的影響 表3結果顯示：HCT-8／5-FU細胞在ECSB干預48 h后，其細胞活力呈劑量依賴性下降。為進一步研究ECSB能否逆轉HCT-8／5-FU細胞對5-FU的耐藥性，采用 50和 100 μg／mL ECSB和不同劑量的5-FU聯合給藥干預HCT-8／5-FU細胞48 h，與單獨5-FU給藥組相比，ECSB聯合5-FU給藥能夠更加顯著抑制HCT-8／5-FU細胞的活力，見表4。以上研究結果證實，ECSB能夠逆轉HCT-8／5-FU對5-FU的耐藥性。

3.4 ECSB對 HCT-8／5-FU細胞中linc01843表達的影響 圖3顯示：在5-FU干預下，HCT-8／5-FU細胞中的linc01843表達顯著高于對照組。而在5-FU和ECSB聯合干預下，HCT-8／5-FU細胞中的linc01843表達則顯著低于單獨5-FU給藥組。該實驗結果表明：ECSB逆轉大腸癌5-FU耐藥的作用機制之一是通過調控linc01843的表達。

表2 linc01843對HCT-8／5-FU細胞活力的影響（±s）%

表2 linc01843對HCT-8／5-FU細胞活力的影響（±s）%

注：與 0 μmol／L 5-FU 組比較，1） P＜0.05；與 negative control組比較，2） P＜0.05。

5-F U（μ m o l／L）0 1 6 0 0 3 2 0 0 6 4 0 0 n 6 6 6 6 n e g a t i v e c o n t r o l組1 0 0.0 0±7.7 0 8 3.4 6±5.7 0 1）7 4.6 7±5.1 7 1）6 6.4 5±6.5 9 1）s i-l i n c 0 1 8 4 3組8 9.2 5±5.5 6 2）7 4.0 9±2.9 9 2）6 6.1 1±2.5 0 2）5 4.9 2±3.7 1 2）

表3 ECSB對HCT-8／5-FU細胞活力的影響（±s）%

表3 ECSB對HCT-8／5-FU細胞活力的影響（±s）%

注：與 0 μg／mL ECSB 組比較，1） P＜0.05。

E C S B／（μ g／m L）0 5 0 1 0 0 1 5 0 2 0 0 2 5 0 n 6 6 6 6 6 6細胞活力1 0 0.0 0±1.5 1 8 6.8 4±6.3 3 1）6 1.1 3±3.4 1 1）4 1.9 2±2.7 9 1）3 2.5 2±0.7 7 1）2 9.1 5±2.0 0 1）

表4 ECSB聯合5-FU對HCT-8／5-FU細胞活力的影響（±s）%

表4 ECSB聯合5-FU對HCT-8／5-FU細胞活力的影響（±s）%

注：與 0 μmol／L 5-FU 組比較，1） P＜0.05；分別與 400、800、1 600、3 200、6 400 μmol／L 5-FU 組比較，2） P＜0.05。

5-F U／（μ m o l／L）0 4 0 0 8 0 0 1 6 0 0 3 2 0 0 6 4 0 0 n 6 6 6 6 6 6 E C S B／（μ g／m L）0 1 0 0.0 0±2.3 7 8 4.3 1±5.1 0 1）8 1.1 3±2.7 5 1）7 6.1 7±1.3 6 1）7 4.4 4±1.8 9 1）7 1.7 4±2.0 8 1）5 0—7 7.6 2±4.4 5 2）7 2.7 4±5.7 8 2）7 1.1 8±2.5 0 2）6 4.4 6±6.1 3 2）6 3.2 1±2.2 0 2）1 0 0—5 1.1 7±5.5 4 2）4 9.6 9±1.2 4 2）5 1.4 5±1.6 9 2）4 8.3 3±2.3 0 2）4 6.7 9±1.9 1 2）

圖3 ECSB對HCT-8／5-FU細胞中linc01843表達的影響

4 討論

腫瘤耐藥是指腫瘤細胞對一種化療藥物產生耐藥性，同時對其他與之化學結構及其作用機制完全不同的藥物也產生交叉耐藥［14］。目前，腫瘤耐藥的作用機制非常復雜，涉及到藥物轉運相關蛋白的異常表達、細胞增殖、凋亡以及上皮—間質轉化紊亂等［15］。現階段研究發現，lncRNA可以通過調控相關信號通路，引起腫瘤細胞增殖、凋亡以及上皮—間質轉化等改變，或直接調控藥物轉運相關蛋白，從而對腫瘤細胞的耐藥產生影響。如過表達lncRNA HOTTIP能夠激活 Wnt／β-catenin信號通路，促進骨肉瘤細胞進入S期，增加其對順鉑的耐藥性［16］。lncRNA H19通過靶向激活生存信號通路中的關鍵蛋白AKT，從而促進多發性骨髓瘤對長春新堿的耐藥性［17］。LncRNA CHRF在卵巢癌順鉑耐藥中的新作用是由miR-10b誘導的EMT和STAT3信號介導的［18］。LncRNA MRUL通過促進藥物轉運蛋白ABCB1的表達，導致化療藥物外排增加，使得胃癌細胞產生腫瘤耐藥現象［19］。

Linc01843是一種lincRNA（long intergenic noncoding RNA），也被命名為 lncRNA AC005355.2，位于 chr5：134506552-134509229：+。 目前，linc01843在腫瘤研究方面的報道較少。本研究首次發現linc01843在5-FU干預后的HCT-8和 HCT-8／5-FU細胞中均呈現高表達，提示其可能和5-FU干預結腸癌細胞有關。在兩株細胞中同時敲低linc01843，發現敲低linc01843后均能增強兩株細胞對5-FU的敏感性，初步證實其參與了5-FU耐藥的過程。

隨著國家對中藥研發的重視，中藥聯合化療藥物治療腫瘤受到人們的廣泛關注。臨床研究顯示，兩者聯合用藥，可減輕化療藥物產生的毒副作用，并降低化療藥物產生的交叉耐藥，同時提高患者的治愈率［20］。先前已有大量文獻顯示，中藥能夠通過調控lncRNA的表達逆轉多種腫瘤對化療藥物的耐藥性［5］。半枝蓮是一種傳統中草藥，在臨床以及基礎實驗均已證明，其能起到良好的抗癌療效［21］。本研究發現，對5-FU存在顯著耐藥性的HCT-8／5-FU細胞，對ECSB不存在耐藥性。ECSB聯合5-FU干預HCT-8／5-FU細胞，可以顯著逆轉 HCT-8／5-FU細胞對5-FU的耐藥性。并且，初步研究也發現，在HCT-8／5-FU 細胞中，5-FU 干預后，linc01843的表達顯著上升，而ECSB聯合5-FU干預后，可顯著下調linc01843的表達。說明ECSB逆轉大腸癌5-FU耐藥的作用機制之一是通過調控linc01843的表達。由于耐藥機制極其復雜，關于linc01843后續的功能以及深入的機制研究，以及半枝蓮調控linc01843的表達后級聯作用于下游的哪些效應蛋白而最終發揮功效，還有待進一步的探討。