梯棱羊肚菌單孢分離、交配型基因鑒定及其菌絲融合雜交研究

賀國強

（北京市農業技術推廣站，北京 100029）

梯棱羊肚菌（Morchella importuna）屬于子囊菌門（Ascomycota）、盤菌亞門（Pezizomycotina）、盤菌綱（Pezizomycetes）、盤菌目（Pezizales）、羊肚菌科（Morchellaceae）、羊肚菌屬（MorchellaDill.Ex Pers.：Fr.），是一類珍稀野生的名貴食用菌。羊肚菌的馴化栽培吸引著大批蘑菇愛好者投身其中。目前羊肚菌室內栽培和室外大田栽培模式均取得了一定成功，對于羊肚菌產業化具有重要意義[1-3]。自2012年我國羊肚菌進入了產業化時期，種植面積由最初的200hm2，迅速增長到了4667hm2左右。但羊肚菌屬于子囊菌，菌種易退化，加之其生理及遺傳研究基礎薄弱，造成了羊肚菌栽培的不穩定性，無法穩定盈利，限制著羊肚菌產業的健康和穩定發展。

目前羊肚菌栽培的菌株普遍采用組織分離的方法獲得，但隨著組織分離、轉代次數的增加等因素影響，會導致菌株中的其中一種交配型基因逐漸減少或衰退，造成減產或無法出菇[4-5]。因此，建立羊肚菌的單孢雜交育種方法對于羊肚菌品種選育至關重要。不同于擔子菌的雜交育種通常以單孢之間拮抗線處的鎖狀聯合作為標記，屬于子囊菌的羊肚菌菌絲沒有明顯的鎖狀結合，需要另外特定的標記以確定是否雜交成功。真菌的交配型基因是控制性發育的1 個基因簇位點。子囊菌中通常含有2 種類型的交配型位點即Mat1-1 和Mat1-2，如果2 個交配型位點位于同1 個細胞核內，即可在分子層面認定為同宗結合真菌；反之如果分布在不同的細胞核上，則被認定為異宗結合真菌，交配型位點的序列沒有同源性，但調節著近等的功能，位點兩側有保守的基因序列，因此稱為idiomphom[6-8]。近年來通過對交配型基因（Mat1-1或Mat1-2）的研究，認為目前已被馴化栽培的梯棱羊肚菌（M.importuna）和六妹羊肚菌為異宗結合真菌，梯棱羊肚菌的子囊孢子雖為多核體，但為同核體[9]。基因組數據也表明，梯棱羊肚菌的交配型基因是單拷貝基因[6，10-11]，可以直接將其作為1 種共顯性核型標記使用。

收集梯棱羊肚菌親本菌株（F0）的單孢群體（F1），利用顯微操作法分離獲得單孢菌株，并對F1單孢群體交配型進行測定，隨后對F1群體間進行實驗室條件下的隨機配對雜交，獲得Fx菌株，以期為羊肚菌育種工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株梯棱羊肚菌栽培菌株M-15、M-CY、M-HM（F0親本菌株）源自商業化栽培菌株和野生馴化菌株，保存于北京市農業技術推廣站食用菌實驗室。采用形態學特征結合ITS 序列分析確證是梯棱羊肚菌。利用自然彈射法收集羊肚菌的子囊孢子。

1.2 單孢分離及純化采用顯微操作技術分離羊肚菌單個子囊孢子。首先采用50%的無菌甘油溶液將孢子稀釋至100 萬個/mL，取50μL 涂布于無菌載玻片，將載玻片置于倒置相差顯微鏡；用拉針儀或手工制備挑針，將做好的毛細管挑針拿在操作手臂上，緩慢將挑針移動至顯微鏡視野內，在視野下用毛細管挑針吸住分散的單個子囊孢子，抬針，將吸取的子囊孢子在無菌操作環境下轉移（小洗耳球吹出）至CYM 完全培養基（酵母粉2g/L、蛋白胨2g/L、K2HPO41g/L、MgSO40.5g/L、KH2PO40.46g/L、葡萄糖20g/L、瓊脂20g/L，加無菌水至1L）平板，置于23℃避光培養，約36～48h 可見萌發形成的單菌落。肉眼觀察平皿內菌絲，并使用顯微鏡進行觀察，若明顯由一個子囊孢子萌發形成輻射狀菌絲，基本可視為單孢菌株。無菌操作及時切取菌絲生長末端的單根菌絲，轉接至新的培養基內，即獲得純化的單孢菌絲。單孢群體F1編號為F1（M）n，M 表示親本菌株名稱，n 為數字編號，代表第n 個單孢。

1.3 交配型基因的測定DNA 的提取中，F0親本菌株、F1單孢群體均為純培養的菌絲體。菌絲體或組織塊經液氮研磨后，用裂解液（CTAB 2%、PVP 2%、Tris-HCl 100mmol/L、EDTA 20mmol/L、NaCl 1.4mol/L）裂解獲得DNA 粗提液，經V（苯酚）∶V（氯仿）∶V（異戊醇）=25∶24∶1 去蛋白后再經乙醇沉淀、RNAase 消解去除RNA 污染，最終獲得純凈DNA，稀釋至50ng/μL，4℃儲存備用。

交配型基因的擴增引物為MAT1、MAT2[10]，P8-4、P6-1[12]，PLiu1、PLiu2。其中引物對MAT1F/R、P8-4F/P8-4R、PLiu1F/R 用于檢測交配型MAT1-1-1，引物對MAT2F/R、P6-1F/P6-1R、PLiu2F/R 用于檢測交配型MAT1-2-1。P8-4F 的核苷酸序列為5′-GCTCTCTTGTGCCCCTTTTGACTAT-3′，P8-4R 的核苷酸序列為5′-TCTACCAGCCATGTGAAAC AAGCAA-3′；P6-1F 的核苷酸序列為5′-GAGA CTCAAATCTGACTGACTTCCT-3′，P6-1R 的核苷酸序列為5′-GAAGAACCTCAGATAAGCGTAAAAT-3′。擴增的目的片段大小分別為1837bp 和1740bp，分別代表MAT1-1-1和MAT1-2-1交配型基因序列全長。25μL 擴增體系包括2×PCRmix（TSINGKE Bio Inc）12.5μL，10μmol/L 的P8-4F、P8-4R 引物各1μL，DNA 模板1μL，ddH2O 9.5μL。PCR 擴增程序為：94℃預變性3min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸90s，30 個循環；72℃延伸10min。所有擴增產物在1.2%（W/V）瓊脂糖凝膠上電泳檢測。

1.4 F1 單孢群體菌絲生長特性測定直接用肉眼觀察菌落特征，主要包括菌絲生長整齊度、顏色、菌核數量。菌絲日均長速的測定：當菌絲體培養到第N 天（96h）時（以菌絲將近長滿平皿而未長滿平皿時作為測量終點），以接種塊為中心用刻度尺測量菌落直徑（mm），隨機測量4 次，取平均值。菌絲日均長速的計算方法：菌絲日均長速（mm/d）=Y（菌落直徑-8mm）÷2÷培養天數（d）。最后取5 個重復的平均值。

1.5 F1 單孢群體平皿內融合按照Volk 等[13]的單孢融合方法，將基因型分別為MAT1-1-1和MAT1-2-1型的單孢分為一組。在90mm 直徑的PDA平板內均分4 個區，分別從MAT1-1-1和MAT1-2-1型組單孢選出2 個單孢菌絲，不同交配型基因按對角線均等排列（為了減少平皿個數），菌絲塊圓柱體的直徑約0.5cm，菌絲塊之間的距離約為4cm。將接種好的各單孢子菌株繼續于25℃恒溫培養，至菌絲體長至兩兩之間相互交匯，觀察現象并記錄。

1.6 雜交融合Fx 菌株的篩選、鑒定從菌絲交匯處隆起部位挑取0.2cm×0.2cm 接種于新的PDA平皿內，25℃恒溫培養，然后檢測其交配型基因類型，若同時含有MAT1-1-1和MAT1-2-1型基因，則可能是雜交融合子。將同時含有MAT1-1-1和MAT1-2-1型基因的疑似融合菌株與相應的親本F1單孢菌株接種于同一個PDA 平皿內，觀察其有無拮抗線，若疑似融合菌株與相應的親本F1單孢菌株兩兩間都有拮抗線存在，則表明雜交成功。

2 結果與分析

2.1 單孢分離及純化待單孢菌絲剛剛萌發時，挑取單根菌絲，接種于新的CYM 平板，編號，進行培養。共挑取399 個單孢，萌發獲得并純化得到141個單孢菌株，成功率35.34%。3 個親本菌株的F1單孢挑取成功率差別較大（表1），F1（M-CY）的單孢挑取成功率最低，僅為26.92%；F1（M-15）、F1（M-HM）的單孢挑取成功率較高，均達到40%以上，可能與各親本菌株的F1單孢的活力有關，從而直接影響了單孢的萌發率，進而影響了單孢挑取的成功率。

表1 顯微操作法挑取單孢的成功率統計

2.2 F1 單孢群體菌絲生理特性由表2 可知，同一親本獲得的單孢群體，在菌絲生長、產生色素方面存在差別。F1（M-15）有1 株單孢產黃褐色素，F1（M-CY）有3 株單孢產黃褐色素，F1（M-HM）無單孢產黃褐色素，但有17 株單孢產灰褐色素。綜合來看，不產色素的菌株最多，占比84.8%，產黃褐色素的菌株占比2.9%，產灰褐色素的菌株占比12.3%。

表2 基于PDA 上的培養特征的單孢菌株分組

由表3 可知，同一親本獲得的單孢群體，單孢的生長速率差別也很大。F1（M-CY）的最小生長速率值最小，為0.85cm/d，F1（M-HM）的最大生長速率值最大，為1.93cm/d，而3 個單孢菌株的平均生長速率相差不大，分別為1.49cm/d、1.46cm/d、1.53cm/d。

表3 單孢菌絲生長速率 （cm/d）

2.3 F1 單孢群體的分型不同引物對的特異性存在較大差別。由表4 可知，相比較使用MAT1F/R、MAT2F/R 引物對，利用P8-4F/P8-4R、P6-1F/P6-1R 引物對可以較好地擴增出MAT1-1-1、MAT1-2-1基因，用于區分出單孢的交配型基因類型，檢出率達87.5%，基本與使用PLiu1F/R、PLiu2F/R引物對結果一致，因此，采用P8-4F/P8-4R、P6-1F/P6-1R 引物對擴增交配型基因。

利用改進的特性引物（P8-4F/P8-4R、P6-1F/P6-1R）進行PCR 擴增，檢測單孢菌株的交配型基因。由表5 可知，共完成93 株單孢菌株的交配型基因分型，經統計分析，MAT1-1-1與MAT1-2-1型單孢菌株數分別為37 株和51 株，比例為0.73∶1。其中F1（M-15）、F1（M-CY）、F1（M-HM）基因型為MAT1-1-1型的菌株數分別為15 株、14 株、8 株，基因型為MAT1-2-1型的菌株數分別為22 株、15 株、14 株。僅有F1（M-CY）中1 株菌株未檢測出交配型基因類型。F1（M-15）中4 株菌株同時檢測出兩種交配型基因類型，重復試驗結果依然如此，可能這4 株菌株為混合孢子，非單孢。

表4 不同引物對單孢菌株的交配型基因的檢出統計

表5 單孢菌株的交配型基因分型統計

2.4 單孢菌株間融合表現將已鑒定的不同交配型基因單孢菌株接種于同一平板，使菌絲接觸，發生融合。初步共完成配對408 個組合。挑取不同交配型基因單孢接觸的融合帶，接種于新的PDA 平板，待菌絲剛萌發，挑取單根菌絲。由表6 可以看出，菌株之間兩兩生長接觸，表現出3 種融合類型：（1）有融合帶（隆起），無色素；（2）有融合帶（隆起），產生褐色素；（3）無融合帶，兩菌株菌絲互相滲透生長。其中第2 種融合類型最多，占比43.4%，第3 種融合類型最少，占比僅為16.9%。

表6 不同交配型單孢菌株的平皿雜交統計

2.5 單孢融合菌株的鑒定將挑取的融合菌株，分別與母本進行拮抗試驗，與親本菌株都存在拮抗的菌株可能是雜交菌株。將與親本菌株都存在拮抗的融合帶菌株進行PCR，測序，鑒定交配型基因類型。鑒定出F1（M-CY）2×F1（M-15）8 同時含有MAT1-1-1型和MAT1-2-1型基因，為融合子。

3 結論與討論

采用顯微操作技術從3 株梯棱羊肚菌栽培菌株（F0）的子囊孢子群體（F1）中分離出單個孢子，進而獲得單孢菌株，并且單孢分離效率較高，達35.34%。顯微單孢分離技術尤其適合孢子較大的羊肚菌，單孢分離成功率較稀釋涂布法高。羊肚菌的子囊孢子較大，約十幾個微米，且識別度高，便于進行顯微操作。此外，相較于稀釋涂布法分離單孢，顯微操作在稀釋倍數合適的情況下，即每個視野內2～3 個單孢，可以較好地排除兩個或多個子囊孢子的粘連（稀釋法易發生），確保分離得到的是單個孢子。F1單孢群體交配型基因分型結果表明，在隨機挑選的93 株單孢分離菌株中，交配型基因分型僅有4 株菌株同時檢測出兩種交配型基因類型，可能這4 株菌株為混合孢子，相較于一般的稀釋法（成功率小于30%）單孢挑取分離成功率很高。

F1單孢群體的菌絲生理特性研究表明，不同單孢的菌絲生長速率差別較大，最小的生長速率和最大的生長速率可相差1 倍。主要是由于子囊孢子是先經過減數分裂，而后再進行一次有絲分裂形成的，基因出現了隨機組合，一個子囊內的8 個子囊孢子有4 種基因型，而由于存在多個基因位點，理論上減數分裂得到的子囊孢子的基因型都不完全相同[14]。因此，分離到的單孢間可能存在差異，表現在菌絲生長速率、菌絲形態、產生色素等方面。

不同交配型基因擴增引物對的特異性存在較大差別。不同于Du 等[10]使用擴增引物MAT1F/R、MAT2F/R 對14 株黑色羊肚菌進行交配型基因的分型，本研究利用P8-4F/P8-4R、P6-1F/P6-1R 引物對可以擴增出MAT1-1-1、MAT1-2-1基因，較好地區分出單孢的交配型基因類型，檢出率達87.5%。這可能與引物與交配型基因的DNA 序列結合的特異性有關。

基于交配型基因的單孢分型，尤其適合于遺傳背景不完備、基因標記缺乏的子囊菌的遺傳標記。本研究中，不同交配型的F1單孢平皿配對試驗，成功篩選出1 個雜交子，為羊肚菌單孢雜交育種工作奠定了基礎。但在平皿內進行單孢雜交，僅僅依靠交配型基因標記難度較大，如何判斷雜交融合成功、如何有效篩選是難點。現有的基于拮抗反應和交配型基因的PCR 法，工作量大；而且基于交配型基因的融合觀察，存在拮抗的干擾；同時挑取融合帶中融合菌絲，存在親本菌絲的干擾，難度較大，效果依然不太理想。因此，需進一步研究有效的篩選標記以提高篩選效率。