馬鈴薯晉薯16 號愈傷組織再生體系的建立

牛瑜琦 孫 蕾 梅 超 王慧杰 宋倩娜 馮瑞云

（1 山西大學生物工程學院，太原 030006；2 山西農業大學農學院，太原 030031）

山西是我國馬鈴薯的主產區之一，種植區域主要分布在山西北部、西北部的丘陵和山地，商品薯產量高，品質優良。由于種植地區多為貧困地區，在精準扶貧力度持續增加的背景下，貧困適種地區的馬鈴薯種植面積呈增加態勢，馬鈴薯產業已逐步成為當地紅色支柱產業[1-2]。近年來，隨著人民生活水平提高，對馬鈴薯品質的要求也相應提高，科技人員在馬鈴薯的品質、產量、抗病性及分子育種方面均取得較大進展[3]。

晉薯16 號是山西省農業科學院高寒區作物研究所在2006 年審定的馬鈴薯品種，產量高達2088kg/667m2，抗病性強，在山西北部、內蒙古烏蒙、河北張家口地區推廣種植，2009-2011 年累計種植4 萬hm2，推廣前景良好[4-6]。在推廣過程中，發現晉薯16 號中抗PVX 和PVY，重感B5-1 晚疫病生理小種，為避免產量降低、抗性退化等問題產生，需對品種進一步改良，篩選并導入具有相關抗性如抗PVX、PVY 病毒基因、抗晚疫病基因等優良基因，打破種間隔離的限制，提高品種抗生物與非生物脅迫的能力，改良品種農藝性狀[7-8]。朱英等[9]研究表明，高效、穩定的遺傳轉化系統是轉基因馬鈴薯育種獲得突變植株的前提。雖然針對馬鈴薯遺傳轉化研究起步較早，但由于不同品種基因型的差異[10-11]，遺傳轉化體系也不盡相同，因此需要建立適合晉薯16 號的遺傳轉化愈傷組織再生體系。

本研究通過對馬鈴薯外植體選擇、外植體表面消毒試劑濃度選擇、根的誘導條件、最佳愈傷組織誘導和分化的植物激素組合及濃度進行研究，初步建立了馬鈴薯晉薯16 號再生體系，以期為馬鈴薯遺傳轉化、品種優化提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料本研究試驗材料為馬鈴薯晉薯16 號的無菌脫毒苗，由山西農業大學農學院馬鈴薯分子育種實驗室提供。

1.1.2 生化試劑激素（6-BA、NAA、GA3等）及MS 培養基等其他常用的生化試劑購自上海生工生物工程公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌苗繁殖培養基及培養條件MS 培養基干粉40g，加蒸餾水定容至1L，攪拌加熱至完全溶解，使用1mol/L NaOH 調整pH 值至5.8～6.0，121℃高壓滅菌20min 后冷卻備用。

在馬鈴薯分子實驗室培養間進行無菌苗繁殖培養，培養溫度25℃，光周期為光16h/暗8h，光照強度2000～2500lx。白天采用日光燈帶與紅藍光燈帶同時補光。

1.2.2 外植體表面消毒取生長4 周的晉薯16 號無腋芽脫毒苗莖段，用以下方法進行消毒：75%的酒精浸泡30s，1.5%、2%和2.5%的次氯酸鈉依次浸泡60s，無菌水清洗3 遍后用濾紙吸干外植體表面液體，置于MS 基礎培養基中培養，每皿20 個莖段，共3 皿，5d 后統計污染數量。

1.2.3 愈傷組織誘導培養基（CIM）及培養條件MS培養基加不同濃度組合的NAA（萘乙酸）、6-BA（6-芐氨基腺嘌呤）和TMT（特美汀）。NAA 設置3 個濃度，分別為0.3mg/L、0.5mg/L 和1.0mg/L；6-BA設置3 個濃度，分別為1.0mg/L、1.5mg/L 和2.5mg/L；TMT 為200mg/L。培養條件和無菌苗繁殖培養相同。

1.2.4 愈傷組織分化培養基（CDM）及培養條件MS 培養基加不同濃度組合的6-BA、GA3（赤霉素）、ZT（玉米素）和TMT。6-BA 設置3 個濃度，分別為1.0mg/L、1.5mg/L 和2.5mg/L；GA3設置5 個濃度，分別為0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L 和2.5mg/L；ZT 為1.0mg/L；TMT 為200mg/L。培養條件和無菌苗繁殖培養相同。

1.2.5 不同外植體的篩選選擇健壯晉薯16 號無菌苗，培養基使用激素配比為NAA 0.1mg/L+6-BA 1.0mg/L+TMT 200mg/L 的CIM 培養基，在馬鈴薯分子實驗室培養間進行愈傷組織誘導，10d 后轉入激素配比為ZT 1.0mg/L+GA31.0mg/L+TMT 200mg/L 的CDM 培養基，每10d 更換CDM 培養基，隨時觀察分化情況。培養溫度25℃，光周期為光16h/暗8h，光照強度2000～2500lx。

采取不同外植體培養：（1）莖段：取1cm 長無腋芽莖段，置于CIM 培養基上；（2）葉片：取邊長約0.5cm 并留部分葉柄的葉片，置于CIM 培養基上。

1.2.6 根的誘導選用1cm 左右帶腋芽的莖段，分別接入含有30g/L、50g/L 和70g/L 蔗糖的MS 培養基內誘導不定根。每皿20 個莖段，每個濃度3 皿，分3 個重復，培養溫度25℃，光周期為光16h/暗8h，光照強度2000～2500lx，隨時觀察不同培養基上根的生長情況，30d 后統計結果。

1.3 數據統計及分析愈傷組織誘導率、芽分化率、根分化率的計算方法見以下公式。試驗數據統計和分析使用Microsoft Excel 和SPSS 18 完成。

愈傷組織誘導率=出現愈傷外植體數/外植體總數×100%

芽分化率=分化出不定芽的外植體數/外植體總數×100%

根分化率=出現不定根的外植體數/外植體總數×100%

污染率=污染的外植體數/外植體總數×100%

2 結果與分析

2.1 外植體的篩選理論上任何外植體在合適的條件下均可脫分化形成愈傷組織，但在實踐中，外植體不同，愈傷組織誘導及不定芽分化的效果不同。試驗選取晉薯16 號無菌苗健壯的葉片及無腋芽莖段為外植體，進行愈傷組織和不定芽的誘導。結果表明，愈傷組織誘導階段，莖段產生較多的愈傷組織，顏色淡綠色，質地緊密；不定芽誘導階段，莖段產生不定芽比葉片速度快且數量多。莖段和葉片的愈傷組織誘導率分別為60%和25%，因此莖段可作為最佳外植體。

2.2 不同濃度次氯酸鈉消毒效果消毒的原則是殺死材料上附著的微生物又不傷害外植體的活細胞。試驗使用3 種濃度次氯酸鈉對外植體表面進行消毒，結果表明，1.5%次氯酸鈉不能有效殺滅外植體上的微生物，外植體顏色淡綠，但污染率20%～30%；2%次氯酸鈉可殺滅多數微生物，外植體兩端有輕微變白現象，并不影響后期愈傷組織誘導及分化；2.5%次氯酸鈉可有效殺菌，但因濃度高，外植體細胞受損嚴重，外植體兩端出現白化死亡現象。因此可選擇使用2%的次氯酸鈉對晉薯16 號莖段外部消毒。

2.3 不同激素及濃度組合對愈傷組織誘導率及質量的影響愈傷組織指在無菌條件下將外植體某一部分置于適宜的培養環境中，加入濃度配比適合的植物激素，經誘導期、分裂期及形成期3 個階段形成的一團不定型組織（由薄壁細胞組成）。因此愈傷組織的誘導率及誘導質量主要受培養條件、植物激素的組合及濃度配比的影響。

晉薯16 號莖段接種到含NAA 和6-BA 的愈傷組織誘導培養基上培養3d 左右，莖段兩端切口處開始膨大，5d 左右出現愈傷組織，愈傷誘導率達70%以上。愈傷組織誘導率及愈傷組織形成質量因2 種激素配比濃度不同出現差異。

由表1 可知，愈傷組織質量及誘導率受NAA和6-BA 影響，6-BA 1.5mg/L+NAA 0.5mg/L、6-BA 1.5mg/L+NAA 1.0mg/L、6-BA 2.5mg/L+NAA 1.0mg/L這3 組誘導培養基中，愈傷組織生長旺盛，質地緊密有光澤，愈傷組織量多且顏色呈黃綠色，莖段無白色不定根出現，誘導率可達87%以上。CIM5 愈傷組織邊緣無褐變，后期在組織分化培養中表現也較好，CIM7 和CIM8 愈傷組織后期褐變嚴重，所以CIM5 為愈傷誘導最佳培養基。培養10d 后觀察，由于培養基中水分、養分的損耗及代謝時有毒物質的積累，愈傷組織塊生長速度漸緩，兩端出現較輕的褐化現象，此時需及時轉移到CDM 培養基中，否則褐化現象將加劇直至莖段死亡。

表1 MS 添加不同濃度NAA、6-BA 對晉薯16 號愈傷組織的影響

2.4 不同激素及濃度組合對愈傷組織分化率影響

由表2 可知，激素6-BA、GA3和ZT 的組合有利于晉薯16 號不定芽的產生，組合6-BA 2.5mg/L+GA31.5mg/L+ZT 1.0mg/L、6-BA 1.0mg/L+GA31.0mg/L+ZT 1.0mg/L 和6-BA 1.5mg/L+GA32.0mg/L+ZT 1.0mg/L芽分化率普遍比較高，可達23%以上，CDM5 的芽分化率最高，達32.6%，分化速度較快，兩周左右可以觀察到較多叢生芽。隨著GA3濃度提高褐化率也提高，添加ZT 對褐化情況有一定抑制作用，愈傷組織量多且質地緊密，分化的速度快。本組實驗中培育出的叢生芽質量好、數量多、容易擴繁，擴繁后的試管苗也比較健壯，說明反式玉米素核苷對馬鈴薯愈傷組織誘導叢生芽有促進作用。

表2 MS 添加不同激素組合及濃度對晉薯16 號愈傷組織分化的影響

2.5 蔗糖對晉薯16 號生根的影響使用馬鈴薯晉薯16 號帶腋芽的莖段為外植體，在添加了30g/L、50g/L 和70g/L 蔗糖的根誘導培養基上培育5～6 周后，觀察生根情況。由圖1 可知，隨著蔗糖濃度的增加，生根率呈先增加后降低的趨勢；蔗糖濃度為50g/L時，生根率最高，為81.3%；蔗糖濃度繼續增加，生根率下降。因此，蔗糖濃度為50g/L 為晉薯16 號生根最適宜的濃度。

圖1 蔗糖濃度對晉薯16 號根誘導的影響

3 討論與結論

在馬鈴薯再生體系外植體的選擇上，馬鈴薯莖段、葉片及莖尖通過組織誘導及分化形成再生植株的再生率較高[6，12]，被認為是經過誘導得到再生植株很好的材料。不同基因型外植體對不同的誘導劑敏感程度不同，對于馬鈴薯來說，常用的生長素是NAA 和2，4-D，細胞分裂素是6-BA，基礎培養基為MS[13-15]。

本試驗以馬鈴薯品種晉薯16 號為外植體，建立了無菌外植體通過愈傷組織誘導及分化途徑的植物離體組織培養體系。愈傷組織誘導通過激素6-BA和NAA 的組合產生，誘導愈傷組織分化叢生芽通過激素6-BA、GA3和ZT 的組合產生，得出晉薯16 號外植體莖段使用濃度為2%的次氯酸鈉消毒效果較好，愈傷誘導外植體選擇莖段較好，晉薯16 號愈傷組織誘導培養基以MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.5mg/L為佳，愈傷組織分化培養基以組合MS+6-BA 1.5mg/L+GA32.0mg/L+ZT 1.0mg/L 為佳，根的誘導使用50g/L 蔗糖。

本研究對山西主要種植品種晉薯16 號高效再生體系進行了建立優化，為后續農桿菌介導的愈傷轉化體系的創建提供重要的基礎和指導，對晉薯16號的品種改良具有重要意義。