洛神花總黃酮提取工藝及其穩(wěn)定性研究

黃 瓊，謝向機，林嘉麗，陳 楠

（1.福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學院，福建 福州 350003；2.三明市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，福建 三明 365000）

洛神花又名玫瑰茄、山茄、洛神葵等[1]，是錦葵科木槿屬的一年生草本植物[2]。洛神花花萼含有豐富的有機酸、碳水化合物、粗蛋白、粗脂肪和總黃酮等物質(zhì)[3]，其中總黃酮具有消炎、抑菌、抗氧化、抗腫瘤等生理作用[4]。目前，洛神花的栽培技術(shù)及化學成分研究報道較多[5-6]，但尚未見洛神花總黃酮提取及其穩(wěn)定性的研究報道。總黃酮提取方法有乙醇熱浸提[7]、微波提取[8]、超聲波提取[9]、超臨界萃取[10]、超聲波微波協(xié)同萃取[11]等，其中超聲波提取具有提取效率高、縮短提取時間等優(yōu)點。本研究采用超聲波提取洛神花總黃酮，響應面法優(yōu)化提取工藝條件，同時考察光照、溫度、pH、常見金屬離子對洛神花總黃酮穩(wěn)定性的影響，以期為洛神花總黃酮的進一步純化和活性研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 材料與試劑

洛神花為市售；蘆丁標準品（純度≥98%），中國藥品生物制品檢定所產(chǎn)品；無水乙醇、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、KCl、NaCl 等化學試劑，均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器與設備

ME204 梅特勒電子天平，UV-1800-DS2 型紫外可見分光光度計，F(xiàn)Z102 微型植物粉碎機，LGR10-4.2型高速冷凍離心機，KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器。

1.2 方法

1.2.1 工藝流程

洛神花花萼→清洗→55 ℃烘干→粉碎→過篩→超聲波輔助提取→離心→取上清液→定容→樣品提取液

1.2.2 洛神花總黃酮含量的測定

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 方法[12]，測定波長510 nm，繪制蘆丁標準曲線，得回歸方程為：C=0.1025A-0.000 51，R2=0.999 9，式中：C為蘆丁質(zhì)量濃度，mg/mL；A為吸光度。表明蘆丁質(zhì)量濃度在0～5.0 mg/mL 范圍內(nèi)與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。根據(jù)標準曲線回歸方程計算出洛神花總黃酮含量。

洛神花總黃酮含量（mg/g）=提取液中總黃酮質(zhì)量（mg）/樣品質(zhì)量（g）

1.2.3 洛神花總黃酮得率的計算

準確移取1.0 mL 樣品提取液置于50 mL 容量瓶并用70%乙醇定容，搖勻，即得稀釋50 倍的樣品溶液。量取1.0 mL 稀釋液置于25 mL 容量瓶中，按繪制標準曲線的步驟，測定樣品吸光度，得樣品總黃酮質(zhì)量濃度，并按下列公式計算洛神花總黃酮得率。

式中：C為樣品提取液總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V為樣品提取液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；M為樣品干粉質(zhì)量，mg。

1.2.4 單因素試驗設計

1.2.4.1 乙醇濃度對洛神花總黃酮得率的影響

設置提取溫度40 ℃，液固比20∶1（mL/g），提取時間20 min，超聲波功率200 W，乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%，考察乙醇濃度對洛神花總黃酮得率的影響。

1.2.4.2 液固比對洛神花總黃酮得率的影響

設置乙醇濃度60%，提取溫度40 ℃，提取時間20 min，超聲波功率200 W，液固比分別為20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1（mL/g），考察液固比對洛神花總黃酮得率的影響。

1.2.4.3 提取溫度對洛神花總黃酮得率的影響

設置乙醇濃度60%，液固比50∶1（mL/g），提取時間20 min，超聲波功率200 W，提取溫度分別為40、50、60、70、80 ℃，考察提取溫度對洛神花總黃酮得率的影響。

1.2.4.4 提取時間對洛神花總黃酮得率的影響

設置乙醇濃度60%，液固比50∶1（mL/g），提取溫度60 ℃，超聲波功率200 W，提取時間分別為20、30、40、50、60 min，考察提取時間對洛神花總黃酮得率的影響。

1.2.4.5 超聲波功率對洛神花總黃酮得率的影響

設置乙醇濃度60%，液固比50∶1（mL/g），提取溫度60 ℃，提取時間50 min，超聲波功率分別為200、250、300、350、400 W，考察超聲波功率對洛神花總黃酮得率的影響。

1.2.5 響應面優(yōu)化試驗設計

采用Box-Behnken 模型，對影響洛神花總黃酮得率的3 個關(guān)鍵因素（液固比、提取溫度、提取時間）進行優(yōu)化設計，響應面試驗因素水平詳見表1。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.2.6 洛神花總黃酮穩(wěn)定性試驗

1.2.6.1 溫度對洛神花總黃酮穩(wěn)定性的影響

取7 份洛神花總黃酮提取液10.0 mL，分別置于30、40、50、60、70、80、90 ℃水浴60 min，取出后冷卻至室溫，測定洛神花總黃酮含量。

1.2.6.2 光照對洛神花總黃酮穩(wěn)定性的影響

取3 份洛神花總黃酮提取液50.0 mL，分別在室外自然光、室內(nèi)自然光和室內(nèi)避光保存0、1、2、3、4、5、6、7 d，測定洛神花總黃酮含量。

1.2.6.3 pH 對洛神花總黃酮穩(wěn)定性的影響

取10.0 mL 洛神花總黃酮提取液共12 份，調(diào)節(jié)其pH 分 別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，靜置60 min，測定洛神花總黃酮含量。

1.2.6.4 常見金屬離子對洛神花總黃酮穩(wěn)定性的影響

取洛神花總黃酮提取液10.0 mL 共9 份，分別加入濃度為0.1 mol/L 的KCl、NaCl、ZnSO4、CuSO4、CaSO4、Al2(SO4)3、FeSO4、NiSO4、MgCl2金屬離子溶液0.10 mL，靜置60 min，測定洛神花總黃酮含量，并作空白對照。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

每組試驗均重復3 次，結(jié)果取平均值。單因素顯著性分析利用SPSS22.0 軟件，響應面設計及優(yōu)化分析利用Design-Expert 8.0.5 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對洛神花總黃酮得率的影響

如圖1 所示，洛神花總黃酮得率隨著乙醇濃度的增大先升高后降低，乙醇濃度為60%時，總黃酮得率最大。原因可能是乙醇濃度越高，越有利于總黃酮溶出，但乙醇濃度過高，醇溶性雜質(zhì)溶出量增多，與總黃酮爭奪溶劑，降低總黃酮得率。因此，乙醇濃度選定為60%。

圖1 乙醇濃度對洛神花總黃酮得率的影響Fig.1 Effects of ethanol concentrations on total flavonoids yields of roselle

2.1.2 液固比對洛神花總黃酮得率的影響

如圖2 可見，洛神花總黃酮得率隨著液固比的增大先升高后降低，液固比為50∶1（mL/g）時，總黃酮得率最大。原因可能是液固比越大，傳質(zhì)推動力越強，總黃酮提取越徹底，但液固比過高會削弱超聲波的輔助作用，影響總黃酮的溶出，降低總黃酮得率。因此，選定液固比為50∶1（mL/g）。

圖2 液固比對洛神花總黃酮得率的影響Fig.2 Effects of liquid-material ratios on total flavonoids yields of roselle

2.1.3 提取溫度對洛神花總黃酮得率的影響

如圖3 所示，洛神花總黃酮得率隨著提取溫度的升高先增加后減少，提取溫度為60 ℃時，總黃酮得率最大。原因可能是總黃酮在高溫下易被破壞，同時增大雜質(zhì)的溶出，對后續(xù)的操作造成一定的影響。因此，選定提取溫度為60 ℃。

圖3 提取溫度對洛神花總黃酮得率的影響Fig.3 Effects of extraction temperatures on total flavonoids yields of roselle

2.1.4 提取時間對洛神花總黃酮得率的影響

如圖4 可示，洛神花總黃酮得率隨著提取時間的延長先增加后減少，提取時間為50 min 時，總黃酮得率最大。原因可能是提取時間短，總黃酮還未完全溶出，但提取時間太長，導致總黃酮被分解，降低總黃酮得率。因此，選定提取時間為50 min。

圖4 提取時間對洛神花總黃酮得率的影響Fig.4 Effects of extraction time on total flavonoids yields of roselle

2.1.5 超聲波功率對洛神花總黃酮得率的影響

如圖5 所示，洛神花總黃酮得率隨著超聲波功率的增大先增加后減少，超聲波功率為350 W 時，總黃酮得率最大。原因可能是超聲功率的增大有利于細胞內(nèi)活性物質(zhì)的釋放，但一些能分解總黃酮的酶也被充分釋放出來，導致總黃酮分解，降低總黃酮得率。因此，選定超聲波功率為350 W。

圖5 超聲波功率對洛神花總黃酮得率的影響Fig.5 Effects of ultrasound powers on total flavonoids yields of roselle

2.2 洛神花總黃酮提取響應面試驗結(jié)果

2.2.1 響應面試驗設計與結(jié)果

綜合單因素試驗結(jié)果可知，液固比、提取溫度和提取時間對洛神花總黃酮得率影響顯著，乙醇濃度和超聲波功率對得率的影響不顯著。因此，選取對得率影響顯著的液固比、提取溫度、提取時間3 個因素進行響應面試驗設計。采用Box-Behnken 模型優(yōu)化設計提取工藝條件，響應面試驗設計方案及結(jié)果見表2，回歸方程方差分析見表3。

表2 Box-Behnken 設計方案及試驗結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and results

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Variance analysis of the regression equation

根據(jù)表2 結(jié)果進行多元回歸擬合，得到二次多項回歸方程式為：

由R2值可知該模型與實際試驗誤差較小。由表3 可見，模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），說明此模型可以預測總黃酮最優(yōu)提取工藝條件。A、B、AB、BC、A2、B2、C2對總黃酮得率影響極顯著（P＜0.01），C、AC對總黃酮得率的影響不顯著。3 個條件對洛神花總黃酮得率影響大小順序為：A液固比＞B提取溫度＞C提取時間。

2.2.2 各因素間的交互作用對洛神花總黃酮得率的影響

等高線變化越密集，該因素對響應值影響越大，根據(jù)圖6～8 等高線疏密程度，得3 因素對洛神花總黃酮得率影響大小順序為：A液固比＞B提取溫度＞C提取時間，再次驗證了表3 的分析結(jié)果。響應面曲線越陡，說明兩者交互作用對響應值影響越顯著，響應曲面越平滑，說明兩者交互作用對響應值影響越不顯著。根據(jù)圖6～8，得液固比和提取溫度及提取溫度和提取時間的交互作用對洛神花總黃酮得率影響顯著，而液固比和提取時間交互作用對洛神花總黃酮得率影響不顯著，再次驗證了表3 的分析結(jié)果。

圖6 液固比和提取溫度的交互作用對洛神花總黃酮得率影響的響應面和等高線圖Fig.6 Contour plot and response surface showing the interactive effects of liquid-material ratios and extraction temperatures on total flavonoids yields of roselle

圖7 液固比和提取時間的交互作用對洛神花總黃酮得率影響的響應面和等高線圖Fig.7 Contour plot and response surface showing the interactive effects of liquid-material ratios and extraction time on total flavonoids yields of roselle

圖8 提取溫度和提取時間的交互作用對洛神花總黃酮得率影響的響應面和等高線圖Fig.8 Contour plot and response surface showing the interactive effects of extraction temperatures and extraction time on total flavonoids yields of roselle

2.2.3 響應面試驗模型的驗證

根據(jù)響應面模型得到優(yōu)化提取工藝條件為：液固比48.53∶1（mL/g），提取溫度59.19 ℃，提取時間50.21 min，洛神花總黃酮得率理論值為3.71%。考慮到操作簡便、實用，最終確定最優(yōu)工藝條件為：液固比50∶1（mL/g），提取溫度60 ℃，提取時間50 min。在此條件下總黃酮得率為3.69%，與理論值（3.71%）相對誤差為0.54%。

2.3 洛神花總黃酮穩(wěn)定性研究

2.3.1 溫度對洛神花總黃酮穩(wěn)定性的影響

如圖9 所示，溫度在30～60 ℃時，洛神花總黃酮含量隨著溫度的升高變化不大，說明洛神花總黃酮在30～60 ℃時穩(wěn)定性好。但溫度升高到60 ℃以上，其含量隨溫度升高而降低，原因是溫度升高加快分子間運動，總黃酮氧化分解。因此，洛神花總黃酮生產(chǎn)和保存應在30～60 ℃環(huán)境中。

圖9 不同溫度下洛神花總黃酮含量的變化Fig.9 Effects of temperatures on stability of total roselle flavonoids

2.3.2 光照對洛神花總黃酮穩(wěn)定性的影響

如圖10 所示，室外自然光下保存時，隨著保存時間的延長，洛神花總黃酮含量降低，原因是洛神花總黃酮對紫外線敏感，室外自然光照射會破壞總黃酮結(jié)構(gòu)；而室內(nèi)自然光對洛神花總黃酮穩(wěn)定性影響較小，避光保存不影響其穩(wěn)定性。因此，室外自然光會影響洛神花總黃酮穩(wěn)定性，故長期保存應避光，短期保存可在室內(nèi)自然光下。

2.3.3 pH 對洛神花總黃酮穩(wěn)定性的影響

如圖11 所示，pH 為1.0～3.0 及6.0～12.0 時，洛神花總黃酮含量降低，pH 為3.0～6.0 時，其含量基本穩(wěn)定。原因是總黃酮苯環(huán)結(jié)構(gòu)中含有酚羥基，顯弱酸性，所以總黃酮在弱酸性的環(huán)境中比較穩(wěn)定。因此，洛神花總黃酮在強酸強堿的環(huán)境中易受到破壞，適宜在弱酸性條件下保存使用。

圖11 不同pH 下洛神花總黃酮含量的變化Fig.11 Effects of pH on stability of total roselle flavonoids

2.3.4 常見金屬離子對洛神花總黃酮穩(wěn)定性的影響

如圖12 所示，同空白組相比較，K+、Na+、Zn2+、Ca2+、Ni2+、Mg2+組洛神花總黃酮含量基本沒有改變，說明K+、Na+、Zn2+、Ca2+、Ni2+、Mg2+對其穩(wěn)定性基本沒有影響；但Al3+、Cu2+、Fe2+組洛神花總黃酮含量降低，且三者的影響大小表現(xiàn)為：Fe2+＞Al3+＞Cu2+，原因是Al3+與總黃酮中的酚羥基形成絡合物，F(xiàn)e2+、Cu2+與提取液的鄰二酚羥基反應生成不溶性絡合物。因此，洛神花總黃酮儲存和食品加工中應避開Al3+、Cu2+、Fe2+金屬離子。

圖12 不同金屬離子條件下洛神花總黃酮含量的變化Fig.12 Effects of metal ions on stability of total roselle flavonoids

3 結(jié)論

（1）采用Box-Behnken 響應面試驗設計法研究超聲波提取洛神花總黃酮最佳工藝條件的結(jié)果表明，影響洛神花總黃酮得率因素大小順序為：液固比＞提取溫度＞提取時間，最佳工藝條件為：乙醇濃度60%，液固比50∶1（mL/g），提取溫度60 ℃，提取時間50 min，超聲波功率350 W，在此條件下，洛神花總黃酮得率為3.69%，與理論值（3.71%）相對誤差為0.54%。

（2）洛神花總黃酮穩(wěn)定性試驗結(jié)果表明，洛神花總黃酮在30～60 ℃下比較穩(wěn)定，在pH 3.0～6.0 下最穩(wěn)定，室外強光和金屬離子Cu2+、Fe2+、Al3+對其穩(wěn)定性影響較大。因此，應在弱酸性條件下保存與使用；洛神花總黃酮儲存和加工中應避光，避高溫，避免接觸強酸、強堿及Al3+、Cu2+、Fe2+金屬離子。