六種蜂蜜的孢粉學(xué)和淀粉酶活性分析

楊 娟，黃新球，曾欽薇，雷樹(shù)明

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661101）

蜂蜜是重要的蜂產(chǎn)品之一，蜂蜜理化指標(biāo)對(duì)劃分蜂蜜等級(jí)極具意義。蜂蜜屬性取決于工蜂采集植物的種類及其在蜂巢內(nèi)的加工程度。蜂蜜質(zhì)量等級(jí)的劃分決定了蜂蜜本身的價(jià)格及價(jià)值，因此，為了更好的明確蜂蜜屬性，本次研究中采用孢粉學(xué)及淀粉酶值活性法劃分云南六種特色蜂蜜的理化屬性。

蜂蜜孢粉學(xué)[1]是通過(guò)檢測(cè)蜂蜜樣品中花粉的種類與比例，進(jìn)行科學(xué)的統(tǒng)計(jì)與分析，能夠得出主要蜜源植物與輔助蜜源植物，以確定蜂蜜是否為表稱產(chǎn)品。Louveaux 等人根據(jù)蜂蜜中的每一種花粉粒個(gè)數(shù)所占的百分比（P），可分為主要花粉(dominant pollen，P≥45%)，次要花粉(secondary pollen，16%≤P＜45%)，少量花粉(important minor pollen，3%≤P＜16%)和微量花粉(minor pollen，P＜3%）[2]。史琦云等[3]采用醋酸酐分解法研究了15 種蜂蜜中的花粉粒，結(jié)果表明，根據(jù)所含主要花粉形態(tài)和數(shù)量可判定是否為單種蜜或混合蜜。用花粉檢驗(yàn)法可以作為生產(chǎn)實(shí)踐中鑒定真?zhèn)蚊鄣目茖W(xué)有效方法。

蜂蜜中酶的含量是檢驗(yàn)蜂蜜質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)，決定了蜂蜜的成熟度、新鮮度、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的高低[4]。蜂蜜的淀粉酶活性通常用淀粉酶值表示，呂成軍[5]采用分光光度法測(cè)定純蜂蜜和摻假蜂蜜的淀粉酶值，認(rèn)為淀粉酶值是檢測(cè)蜂蜜質(zhì)量好壞的一個(gè)重要指標(biāo)，且淀粉酶值越高、品質(zhì)越好。此外，蜂蜜的淀粉酶值也可以作為鑒別蜂蜜是否摻雜、摻假的依據(jù)，陳宜君等[6]鑒別118 件蜂蜜樣品的真假，指出摻假蜂蜜淀粉酶活性值顯著低于真蜜，且?guī)缀鯙榱恪５矸勖钢祵?duì)鑒別蜂蜜質(zhì)量具有靈敏性，易判斷。

本次研究中，我們擬采集一周年中盛花期里蜂場(chǎng)內(nèi)的蜂蜜，以孢粉學(xué)和淀粉酶值檢測(cè)，以期反映出蜂蜜的質(zhì)量，可為蜂蜜質(zhì)量?jī)?yōu)劣評(píng)價(jià)方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

樣品來(lái)源：蜂蜜樣品取自國(guó)家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系紅河綜合試驗(yàn)站示范蜂場(chǎng)，當(dāng)蜂場(chǎng)周邊的苕子花、石榴花、鬼針草花、益母草花、野藿香花、野壩子花進(jìn)入大流蜜期時(shí)用樣品采集吸管吸取巢脾中的蜂蜜，樣品標(biāo)為1#、2#、3#、4#、5#、6#。

主要儀器：AL204 分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海） 有限公司；XYJ-A 電動(dòng)離心機(jī)，常州澳華儀器有限公司；HHS-4S 恒溫水浴鍋，上海宜昌儀器紗篩廠；BM12-C 數(shù)碼生物顯微鏡，上海光學(xué)儀器廠；722S 可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

供試藥劑：冰乙酸，醋酸酐，濃硫酸，碘，碘化鉀，乙酸鈉，氯化鈉，可溶性淀粉等試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為GB/T 6682 規(guī)定的一級(jí)水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蜂蜜孢粉學(xué)測(cè)定方法

蜂蜜樣品前處理：蜂蜜的孢粉學(xué)分析采用改良的醋酸酐分解法[7]，精確稱量蜂蜜樣品10.00 g，用20 mL 30℃的蒸餾水溶解。離心處理，3000 r/min 離心10 min，棄上清液；加入2 mL 冰乙酸，搖勻，靜置2h；再次離心，3000 r/min 離心10 min，棄上清液。加入新配制的醋酸酐-濃硫酸(9: 1)混合液1 mL，85℃下水浴8 min。取出后冷卻待檢。

蜂蜜中花粉的種類和百分比(pollen type and percent)測(cè)定：取干凈的載玻片，于載玻片中心處滴入一滴樣液，蓋上蓋玻片，先于16×4 倍視野下查找花粉粒位置，然后在16×10 倍顯微鏡下觀測(cè)，每張玻片觀察10 個(gè)視野，對(duì)照制備好的蜜源植物花粉圖片，鑒別蜂蜜中的花粉種類，同時(shí)記錄每個(gè)視野中各種花粉的個(gè)數(shù)，得出蜂蜜中花粉的種類和每種花粉所占百分比。不同的蜂蜜樣品需要做3 次平行實(shí)驗(yàn)，花粉率計(jì)算見(jiàn)式（1）

1.2.2 淀粉酶活性測(cè)定方法

蜂蜜中淀粉酶值測(cè)定方法參照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 18932.16-2003 蜂蜜淀粉酶值的測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定[8]。將標(biāo)定的淀粉溶液加到待測(cè)樣品液中，由于蜂蜜中所含的淀粉酶水解部分淀粉后剩余的淀粉與碘反應(yīng)而產(chǎn)生藍(lán)紫色，并隨著反應(yīng)的進(jìn)行而逐漸消失。在660 nm 波長(zhǎng)處以分光光度計(jì)測(cè)定其達(dá)到特定吸光度所需要的時(shí)間，以此換算出1 g 蜂蜜在1 h 內(nèi)水解1%淀粉的毫升數(shù)，不同的蜂蜜樣品需要做3 次平行實(shí)驗(yàn)。

1.3 數(shù)據(jù)處理：

數(shù)據(jù)以Excel 收集，進(jìn)行簡(jiǎn)單處理后，采用SPSS19.0 軟件，進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

圖1 蜂蜜樣品種所含花粉的種類數(shù)量

通過(guò)鏡檢，供試蜂場(chǎng)蜂蜜中的花粉種類結(jié)果見(jiàn)圖1，6 個(gè)蜂蜜樣品中石榴蜜和野藿香蜜中所含花粉種類最少的為3 種，最多的為益母草蜜和野壩子蜜，為6 種，種類間存在差異（P＜0.01）。進(jìn)一步的從上圖可以看出，石榴及野藿香盛花期間，其他輔助的蜜粉源植物較少，與之相對(duì)的野壩子、益母草、苕子等花盛開(kāi)時(shí)輔助的蜜粉源植物也在同一時(shí)期開(kāi)花，從而增加了蜂蜜中其他植物的花粉孢子。

2.2 蜂蜜中主要花粉的花粉率

表1 6 種蜂蜜中主要花粉的花粉率

6 種已知對(duì)應(yīng)蜜源植物的蜂蜜樣品中主要花粉的花粉率含量均大于45%，見(jiàn)表1，根據(jù)Louveaux 認(rèn)為某種蜂蜜中主要花粉率大于45%即可認(rèn)定為某個(gè)品種的單花種蜂蜜，由此可鑒定苕子花蜂蜜、石榴花蜂蜜、鬼針草蜂蜜、益母草蜂蜜、野藿香蜂蜜、野壩子蜂蜜為對(duì)應(yīng)蜜源期花種蜂蜜，即表稱產(chǎn)品。

2.3 蜂蜜中淀粉酶活性

表2 6 種蜂蜜的淀粉酶值

6 種蜂蜜中淀粉酶值結(jié)果見(jiàn)表2。1～>6 號(hào)蜂蜜樣品均具有淀粉酶活性，淀粉酶值差異顯著，鬼針草蜂蜜最高，為34.8 mL/(g.h)、苕子花蜂蜜、益母草蜂蜜的淀粉酶值相對(duì)較高，野壩子蜂蜜的淀粉酶值最低，為9.06 mL/(g.h)，差異顯著（P＜0.01）。吸光度達(dá)到0.235 時(shí)相對(duì)應(yīng)的時(shí)間越短，說(shuō)明蜂蜜中的淀粉酶水解淀粉的時(shí)間越快，同時(shí)也說(shuō)明蜂蜜中的淀粉酶活性越強(qiáng)。因此，鬼針草蜂蜜、苕子花蜂蜜、益母草蜂蜜的淀粉酶活性最強(qiáng)，野壩子蜂蜜的淀粉酶活性最弱。

3 結(jié)論與討論

蜂蜜的理化屬性取決于蜜粉源的種類及地理環(huán)境的相互作用。蜂蜜孢粉學(xué)是確定蜂蜜物理屬性的重要指標(biāo)，可以確定蜂蜜的品種、質(zhì)量及蜜源地的植物種類、開(kāi)花季節(jié)等信息，同時(shí)也在蜂蜜產(chǎn)品的摻假檢驗(yàn)中逐漸受到重視[9]。在本次研究中，我們以蜂蜜孢粉學(xué)檢測(cè)手段確認(rèn)了草壩鎮(zhèn)的六種蜂蜜中花粉孢子的種類（圖1），發(fā)現(xiàn)不同花期中蜂蜜所含的花粉孢子種類不一樣，明確了不同花期中顯花的植物種類。

蜂蜜孢粉學(xué)方法可以有效鑒別蜂蜜是否為表稱產(chǎn)品，以確定某一地區(qū)中蜜粉源植物的豐富程度。陳順安[10]（2011） 研究云南武定野壩子蜂蜜孢粉學(xué)分析，明確了當(dāng)?shù)匾皦巫臃涿奂兌容^高。桑麗琴[11]等（2021） 以電鏡掃描中蜂蜜花粉孢子的結(jié)構(gòu)，探索了秦嶺中華蜜蜂的蜜源木本植物種類。在本文研究的6 種蜂蜜樣品中，1～>6 種蜂蜜均采自不同的蜜源植物，對(duì)其進(jìn)行主要花粉率檢測(cè)，其值均大于45%（表1），可以判定其為某個(gè)品種的單花種蜂蜜，與根據(jù)采集的蜜源植物名稱對(duì)其命名相符。在光鏡下各種孢粉具有比較鮮明的區(qū)分特征，所有蜂蜜中除含有本種花粉外，還含有比例不等的其他多種孢粉(雜質(zhì)孢粉)，不同蜂蜜含有的雜質(zhì)花粉的比例也不相同。孢粉的特征和比例可以作為判定蜂產(chǎn)品品質(zhì)的輔助依據(jù)，但部分蜂蜜在判斷產(chǎn)地方面比較困難[12]。

淀粉酶是蜂蜜中較為重要的一種酶，蜂蜜中酶值的高低在鑒定蜂蜜的品質(zhì)[13]、成熟與否[14]、東西方蜜蜂[15]、大蜜蜂與黑色大蜜蜂[16]、黑小蜜蜂蜜種[17]分辨中均有較好的運(yùn)用。從表2 可知，鬼針草蜂蜜的淀粉酶值為34.8 mL/(g.h)，顯著高于野壩子（9.06 mL/(g.h)） 蜂蜜，可為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)鬼針草類蜂蜜奠定基礎(chǔ)。