A549肺癌細胞條件培養液促進人骨髓間充質干細胞的增殖和遷移*

姜 楊 王璐璐 金海峰 姚立杰 張 嵩 劉丹陽 李永濤 張善強 沈 雷△

（齊齊哈爾醫學院，1 解剖學教研室，2 細胞生物學教研室，3組織學胚胎學教研室，齊齊哈爾 161006）

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）是促成肺癌發生的因素之一[1]。趨化因子濃度增高能夠誘使細胞歸巢[2]。趨化因子-8（C-X-C motif chemokine ligand-8，CXCL-8）除了促進MSC運動[3]，還在結腸癌、膀胱癌等腫瘤組織高表達[4-5]，并是預測宮頸癌發生的重要指示[6]，再次證實CXCL-8 對腫瘤細胞遷移具有關鍵作用。Akt 通路調節的肌動蛋白收縮導致細胞運動[7]，CXCL-8可活化血管內皮細胞Akt-STAT3 通路[8]，促進血管新生[9]。CXCL8 為促進腫瘤生長轉移提供了新血管形成、細胞運動等基礎條件[10]。雖然非小細胞肺癌高表達的CXCL-8 促進了肺癌發展[11]，但是肺癌細胞通過CXCL8 招募MSC 歸巢的作用和機制仍不清楚。本實驗在細胞水平觀察A549細胞表達的CXCL-8 通過Akt 通路對人骨髓間充質干細胞（human bone marrow mesenchymal stem cells，hBMSCs）增殖或運動產生的影響，研究結果將為抑制肺癌提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料

hBMSCs 購于武漢普諾賽生命科技有限公司。A549細胞和BEAS-2B 細胞均購于美國菌種保存中心（American Type Culture Collection，ATCC）。人CXCL-8 重組蛋白和triciribine（美國Selleck 公司）；DMEM/F12 培養基、α-MEM 培養基、DMEM培養基、胎牛血清（美國Gibco 公司）；RIPA 細胞裂解液、BCA 蛋白定量檢測試劑盒等試劑（上海碧云天生物科技公司）；人CXCL-8、Akt、P-Akt蛋白ELISA 試劑盒（美國Antibodies 公司）；MTT、L-谷氨酰胺、二甲基亞砜（美國Sigma 公司）；Annexin V-PI 細胞凋亡試劑盒（美國Hyclone 公司）。

1.2 細胞培養

A549細胞、BEAS-2B 細胞分別用含10%胎牛血清的DMEM/F12 培養基或DMEM 培養基培養。含10% 胎牛血清，2 mmol/L L-谷氨酰胺的α-MEM培養基培養hBMSCs。4.5×106個/mL A549細胞或BEAS-2B細胞在37℃、5%CO2培養12 h，800 r/min 離心5 min，分別提取A549細胞和BEAS-2B細胞上清液，0.22 μm 濾器抽濾，液氮保存。正常條件下，無任何刺激的hBMSCs 為對照組。以體積比1∶4 稀釋A549細胞或BEAS-2B 細胞上清液為條件培養基[12]，條件培養基培養的hBMSCs 為A549組 或BEAS-2B組；3組均添加50 nmol/L CXCL-8則為A549 C組和BEAS-2B C組；若同時添加100 nmol/L triciribine則分別為A549 CT組 和BEAS-2B CT組。A549組加入100 nmol/L triciribine 則為A549 T組。

1.3 ELISA 檢測CXCL-8、Akt 或P-Akt蛋白含量

人ELISA試劑盒檢測A549細胞和BEAS-2B細胞上清液中CXCL-8蛋白含量。4℃，以RIPA細胞裂解緩沖液裂解密度為4.5×106個/mL各組hBMSCs，10 000 r/min離心5 min；BCA蛋白定量檢測試劑盒檢測總蛋白濃度后，再以人ELISA試劑盒檢測各組hBMSCs中Akt或P-Akt蛋白的含量[8]。

1.4 Transwell 細胞遷移實驗檢測hBMSCs遷移數目

1.5×104個/mL hBMSCs置于Transwell細胞小室內，下層腔室加入按實驗分組設置而添加的試劑或條件培養基，37℃，5%CO2培養12 h，擦除transwell細胞小室內hBMSCs，0.01 mmol/L PBS 清洗3次，每次1 min；4%多聚甲醛溶液固定transwell細胞小室60 min，0.01 mmol/L PBS清洗3次，每次1 min；1%結晶紫染色30 min。Image-Pro Plus 6.0.1（IPP 6.0.1）軟件計算單位面積下被結晶紫染色的hBMSCs遷移數目。

1.5 MTT 檢測細胞增殖吸光度

0.6×104個/mL hBMSCs加入96孔細胞培養板，37℃，5%CO2培養12 h；按照實驗分組分別加入各組條件培養基或試劑。37℃，5%CO2培養12 h；加入5 g/L MTT 溶液，37℃，5%CO2繼續培養4 h，再添加二甲基亞砜，Emax Plus 酶標儀在490 nm 波長檢測細胞增殖吸光度（absorbance value，A490值）。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡

用1.25% Annexin V-FITC溶液重懸2×105個/mL各組hBMSCs，孵育20 min；10 000 r/min離心5 min；0.01 mmol/L PBS清 洗3次，每次1 min；加 入2%PI溶液，冰上孵育2 min，10 000 r/min離心5 min，0.01 mmol/L PBS重懸。FACSAria Ⅱ型流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.7 統計學處理

實驗數據采用SPSS 18.0 軟件進行統計分析。計量資料以±s表示，組間比較采用方差分析，計數資料采用χ2檢驗，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 hBMSCs 增殖

對照組、BEAS-2B組、A549組、BEAS-2B C組、A549 C組、A549 T組、A549 CT組 和BEAS-2B CT組的A490值分別為0.91±0.05、0.93±0.06、1.13±0.01、1.35±0.07、1.72±0.09、0.94±0.11、1.39±0.06、1.04±0.03，各組hBMSCs增殖的A490值差異具有統計學意義（P＜0.01）。相對于BEAS-2B組和對照組，A549組A490值升高；A549 C組hBMSCs細胞A490值最高；A549 CT組比A549 C組A490值降低。這提示CXCL-8能夠促進hBMSCs增殖；A549細胞上清液含有促進hBMSCs增殖的活性成分。

2.2 hBMSCs 凋亡

對照組（43.1%）、BEAS-2B組（40.9%）、A549組（31.2%）、BEAS-2B C組（26.1%）、A549 C組（10.3%）、A549 CT組（13.4%）、BEAS-2B CT組（29.0%）、A549 T組（37.2%），各組細胞凋亡率相比差異具有統計學意義（P＜0.01）（圖1）。A549組hBMSCs 凋亡率比BEAS-2B組和對照組顯著降低；A549 C組hBMSCs 凋亡率最低，添加了Akt抑制劑的各組hBMSCs 凋亡率比相應各組hBMSCs凋亡率均呈升高趨勢。結合細胞增殖實驗結果，共同提示A549細胞能夠促進hBMSCs 增殖，抑制hBMSCs 凋亡，說明A549細胞分泌的上清液中含有提高hBMSCs 活性的有效因子（圖1）。

圖1 流式細胞儀檢測各組hBMSCs 細胞凋亡

2.3 hBMSCs遷移

Transwell細胞遷移實驗結果顯示（圖2），對照組、BEAS-2B組、A549組、BEAS-2B C組、A549 C組、A549 T組、A549 CT組 和BEAS-2B CT組 穿過transwell 細胞小室基膜的hBMSCs 數目分別為40.53±1.13、42.72±1.55、59.64±1.95、53.67±2.04、75.05±1.37、43.83±2.16、61.32±2.13、35.94±1.81，各組hBMSCs遷移數目差異具有統計學意義（P＜0.01）。相對于BEAS-2B組和對照組，A549組hBMSCs遷移數目升高；A549 C組hBMSCs遷移數目最高；A549 CT組 比A549 C組遷移數目降低。提示CXCL-8 促進hBMSCs遷移的作用可被Akt 抑制劑所抑制。

圖2 Transwell 細胞遷移實驗檢測各組hBMSCs 的12 h 細胞遷移，標尺=100 μm

2.4 A549細胞和BEAS-2B細胞上清液中CXCL-8蛋白的含量

ELISA 驗證A549細胞上清液中含有的活性因子顯示，A549上清液中CXCL-8含量是（13.108±0.120）ng/L，BEAS-2B上清液CXCL-8含量為（6.053±0.340）ng/L，2組數據相比，差異具有統計學意義（P＜0.01）。

2.5 hBMSCs 的Akt、P-Akt蛋白含量情況

ELISA結果顯示各組hBMSCs的Akt和P-Akt蛋白含量分別為：對照組（7.54±1.04）mg/L和（6.93±1.13）mg/L ；BEAS-2B組（7.60±1.69）mg/L和（6.82±1.07）mg/L；A549組（14.27±1.53）mg/L 和（11.92±1.18）mg/L ；BEAS-2B C組（19.03±1.45）mg/L和（16.69±1.02）mg/L；A549 C組（31.52±1.78）mg/L和（29.08±1.93）mg/L；A549 T組（26.31±1.59）mg/L 和（18.42±1.63）mg/L ；A549 CT組（13.23±1.31）mg/L 和（12.90±1.77）mg/L和BEAS-2B CT組（9.24±1.55）mg/L和（6.22±1.43）mg/L。各組hBMSCs的Akt蛋白含量差異具有統計學意義（P＜0.01），P-Akt蛋白含量差異也具有統計學意義（P＜0.01）。相對于BEAS-2B組和對照組，A549組Akt 和P-Akt蛋白含量明顯升高；A549 C組Akt和P-Akt蛋白含量明顯最高；添加了Akt 抑制劑的各組細胞Akt 和P-Akt蛋白含量比相應各組呈降低趨勢。以上結果證明：A549細胞上清液含有的CXCL-8 通過激活hBMSCs 內Akt信號通路，促進hBMSCs 增殖和運動。

3 討論

3.1 A549細胞表達CXCL-8提高hBMSCs增殖或遷移能力

轉移性癌細胞通常不能用傳統的外科或放化療策略根除，治療后疾病復發極為常見，清除腫瘤干細胞是抑制腫瘤發生發展的關鍵[13]。干細胞治療方法在癌癥治療中顯示出越來越大的希望。干細胞通過歸巢能到達原發性或轉移性腫瘤病灶，并以載體的形式穩定表達靶向抗腫瘤藥物，可減小腫瘤體積，延長存活時間，減輕治療副作用[14]。闡明MSC等干細胞歸巢到惡性腫瘤微環境的機制，提高MSC歸巢率是開展MSC在惡性腫瘤治療的前提。

MSC 廣泛分布在骨髓、脂肪、臍帶血等多種組織，容易分離和體外培養。MSC 可多向分化為骨、軟骨、脂肪、血管等組織，還能分泌SDF-1α、VEGF、EGF 等大量趨化因子、生長因子等生物活性分子，對維持MSC 干性起著至關重要的調節作用[15]。研究表明，與腫瘤細胞活性相類似，MSC也具有易遷移、向組織歸巢運動能力[16]。肺癌細胞與MSC 相互影響，相互促進，MSC 在肺癌等惡性腫瘤的發展和轉移中扮演關鍵作用[17]。目前發現MSC 具有定向遷移到腫瘤組織，促進腫瘤轉移的能力，與胃癌、乳腺癌等多種癌癥進展有關，表現出較好地維持腫瘤生長的能力[18]。但是從趨化因子角度闡明肺癌組織招募MSC 的機制還不清楚。

本實驗采取A549 為研究對象，觀察A549 肺癌細胞上清液對hBMSCs 增殖、凋亡和遷移作用效果和機制。相關實驗結果提示A549細胞上清液中可能具有活化hBMSCs 的活性物質。袁哲等[19]將A549細胞條件培養基按照體積濃度分為高濃度（100%）和低濃度（50%）2組，使用MTT 和transwell 細胞遷移實驗分別觀察對人臍帶血MSC增殖和遷移的影響，顯示低或高濃度A549 條件培養基均明顯促進人臍帶血MSC 增殖和遷移率，尤以高濃度組實驗結果為甚。本實驗研究結果與該研究相符。但是袁哲等[19]并未對A549細胞條件培養基對人臍帶血MSC 凋亡效果或招募人臍帶血MSC歸巢的機制進行分析。本研究深入開展了Annexin V-PI 細胞凋亡實驗，觀察到A549細胞上清液還可以降低hBMSCs 的細胞凋亡率，推測A549 上清液中可能含有某些激活hBMSCs 的活性因子。

張鵬等[20]報道CXCL-8 對人脂肪間充質干細胞具有較好的促進運動能力。趨化因子對多種惡性腫瘤發生發展具有較好調控能力。食管癌表達的CXCL-8（又稱IL-8）通過激活STAT3信號通路，抑制NK 細胞定向趨化到癌組織，進而促進食管癌轉移和復發[21]。本研究采用ELISA 實驗顯示A549上清液中CXCL-8表達明顯升高，與CXCL-8 在惡性腫瘤組織較高表達的結果相一致[21]。為了進一步驗證CXCL-8在A549細胞對hBMSCs的影響，實驗又設立了陽性對照組，即向BEAS-2B組或A549組添加了CXCL-8重組蛋白。結果顯示，BEAS-2B C組hBMSCs增殖或遷移率明顯比BEAS-2B組升高，A549 C組的增殖或遷移率呈現最高，進一步說明CXCL-8在A549細胞條件培養基誘導hBMSCs增殖和遷移能力方面發揮了重要作用。

胰腺癌、胃癌等腫瘤表達CXCL-8 會促進血管新生[22-23]。CXCL-8除了對MSC等細胞具有較強招募作用外[8，20]，還能夠促進MSC分泌VEGF，促使血管內皮細胞黏附，加速血管新生等作用[8，22-23]。本實驗只檢測了CXCL-8一種趨化因子含量，A549細胞分泌的上清液可能還含有其他炎癥因子或趨化因子，這些活性成分的檢測還需要借助高效液相色譜技術或基因芯片等手段進一步驗證。

3.2 A549細胞表達CXCL-8激活hBMSCs內Akt信號通路

添加triciribine 的A549 CT組hBMSCs增殖和細胞遷移率降低，細胞凋亡率升高，更說明A549細胞上清液通過Akt信號通路發揮作用。A549組hBMSCs 的Akt 和P-Akt蛋白表達均明顯增加；A549 CT組hBMSCs 的Akt 和P-Akt蛋白表達均明顯降低。這說明A549細胞上清液中的CXCL-8與hBMSCs 表面的CXCR1/2 受體結合[24]，能夠激活hBMSCs 內Akt信號通路。結合使用Akt 抑制劑的A549 CT組實驗結果，再次證明A549 能夠表達CXCL-8 趨化因子，通過Akt信號通路發揮了招募MSC 歸巢的作用。如果阻斷Akt信號通路或其下游的mTOR等相關蛋白，CXCL-8會降低MSC歸巢效率，更說明CXCL-8 通過PI3K-Akt-mTOR信號通路使更多的MSC歸巢。

綜上所述，A549細胞微環境表達的CXCL-8激活hBMSCs 內Akt信號通路，促進hBMSCs 增殖或遷移，對闡明腫瘤微環境與MSC相互作用，揭示肺癌干細胞來源，尋找抑制肺癌發生發展的方法具有非常重要的意義。