光照應激對雌性大鼠性激素水平和卵巢組織腫瘤壞死因子α、γ干擾素蛋白表達的影響*

周 知 黎業娟 陳 琳 王安國 阮海玲 馬 寧 周 璟 涂志華

（海南省婦女兒童醫學中心生殖醫學中心，?？?570206）

各種應激以及壓力影響始于大腦，隨后影響機體組織和靶器官。應激反應通過神經、心血管、免疫和代謝系統的反應促進機體適應和生存[1]。隨著現代工作時間的延長，人們對于光照的依賴也隨之加強，尤其是晚上加班更是加強了光照對機體的影響，一定時長的光照壓力引起大腦內分泌失調，進一步影響全身[2-3]。慢性應激會引起機體行為的改變，機體表現出形態和生理變化，但目前尚不清楚持續數月的光照應激是否會對機體尤其是生殖系統產生不可逆轉的影響[4-5]。卵巢早衰是一種原發性卵巢損傷，大約影響1%的女性[6]。其最嚴重的癥狀是青春期發育不全和原發性閉經（大約50%是由于卵巢發育不全引起的），與生理性更年期的情況一樣，卵巢早衰的臨床特征是低水平的性腺激素（雌激素和抑制素）和高水平的促性腺激素促黃體生成素（luteinizing hormone，LH）和卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH），可能導致不孕癥或嚴重的神經、代謝、免疫或心血管機能紊亂，并導致骨質疏松癥的早期發病[8]。本研究通過給予雌性大鼠不同的光照強度，探究其對大鼠性激素水平、動情周期變化以及卵巢組織中腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）蛋白的表達的影響，以探討不同的光照強度對于雌性大鼠生殖腺的影響。

1 材料和方法

1.1 動物模型制備與分組

通過陰道涂片實驗篩選出SPF級2月齡左右的性成熟雌性SD大鼠100只，隨機抽取20只作為對照組，其余80只為光照應激干預組（光照組）。對照組放置于常規環境，模擬正常晝夜節律（光照時間：黑暗時間=12 h：12 h），每日隨機飲食水；光照組置于飼養室中飼養，每日為晚8點至早8點持續（2周）給予不同的強度光照，即20、40、60、100 W日光燈直射，距離約 2.5 m（20、40、60和100W對應的照度為251、502、754 和1 256 Lux），分別設為20 W組、40 W組、60 W組、100 W組，早8點至晚8點避免一切光照，放置于黑暗環境。在飼養過程中，20 W組、40 W組、60 W組各組給予相同飲水（250 mL）和食物（500 g），于固定時間觀察檢測大鼠的生物學表征如體質量、進食量以及飲水量等。6個月光照應激結束后，將各組大鼠麻醉，腹主動脈采血，離心取上清液以備用。取大鼠一側卵巢包埋用以做免疫組織化學檢測，另一側卵巢用錫紙包埋后迅速放入液氮中。

1.2 ELISA 法檢測各組大鼠血清中性激素水平

將大鼠血液3 000 r/min 離心 15 min，取上層血清置于潔凈的EP 管中，嚴格按照ELISA 試劑盒說明書要求，測定大鼠血清FSH、雌二醇、LH 的水平，在酶標儀上450 nm 波長依序測量各孔吸光度（A450）值。

1.3 免疫組織化學顯色檢測卵巢組織TNF-α、IFN-γ蛋白的表達

切片脫蠟，PBS 洗 3次，微波爐內進行抗原修復，加H2O2處理，滴加封閉液，PBS 洗3次后滴加稀釋好的TNF-α、IFN-γ 抗體（1∶100）孵育30 min，4℃過夜。滴加適量生物素標記二抗工作液，37℃ 孵育 15 min。滴加適量的辣根酶標記的鏈霉卵白素工作液，37℃ 孵育 20 min。給予辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃孵育 25 min，顯色劑顯色 3～15 min，自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。顯微鏡下觀察染色結果。卵巢組織標本中細胞質出現淡黃色或黃色顆粒狀著色為陽性表達，采用 IPP 6.0 軟件在同等條件下檢測每張TNF-α 或IFN-γ組織切片中的 IFN-γ表達的積分光密度（A450）值。

1.4 統計學處理

采用SPSS 22.0 軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA），進一步兩兩比較用q檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠動情周期變化

與對照組相比，光照組大鼠動情周期顯著延長，且隨著光照強度以及時間的推移動情周期延長更為顯著，其中動情間期、動情前期、動情期持續時間差異無統計學意義（P＞0.05），但動情后期顯著延長（P＜0.05）（表1）。

2.2 各組大鼠血清中性激素的含量變化

與對照組比較，40 W組、60 W組、100 W組大鼠血清中雌二醇含量顯著降低（P＜0.05），FSH、LH 的含量顯著升高（P＜0.05）（表2）。

表1 各組大鼠動情周期比較（±s，d）

表1 各組大鼠動情周期比較（±s，d）

*P＜0.05 vs 對照組

組別 動情周期 動情間期 動情前期 動情期持續時間 動情后期對照組 5.24±0.87 1.29±0.35 1.32±0.39 1.52±0.35 1.89±1.12 25 W組 6.54±1.74 1.53±0.48 1.51±0.63 1.84±0.47 2.64±1.90 40 W組 6.89±1.85 1.76±0.37 1.75±0.59 2.12±0.34 3.01±1.14 60 W組 8.14±1.27* 2.04±0.48 2.08±0.76 2.72±0.52 3.15±1.57*100 W組 10.89±1.84* 2.24±0.48 2.42±0.63 2.84±0.39 6.64±1.90*

2.3 TNF-α、IFN -γ在各組大鼠卵巢組織中的表達

TNF-α 蛋白主要在對照組大鼠卵巢細胞質中表達，少量在間質和黃體中表達；在不同光照組大鼠細胞質、黃體及間質中高表達，且隨著光照強度的增強，各光照組大鼠卵巢中TNF-α 蛋白表達均上升（圖1，表3），其中60 W組、100 W組大鼠與對照組大鼠比較，卵巢中TNF-α 蛋白表達較低，差異有統計學意義（P＜0.05），而25 W組、40 W組大鼠與對照組差異無統計學意義（P＞0.05）。

表2 各組大鼠激素水平的變化（±s）Tab2 Changes of hormone level in each group（±s）

表2 各組大鼠激素水平的變化（±s）Tab2 Changes of hormone level in each group（±s）

*P＜0.05 vs 對照組

組別 雌二醇（pg/mL）卵泡刺激素（mlU/mL）促黃體生成素（mlU/mL）對照組 48.21±4.85 2.34±0.67 3.72±1.13 25 W組 42.58±7.51 3.57±0.89 4.15±1.51 40 W組 38.42±6.11 4.14±0.35 4.75±0.45 60 W組 30.51±5.34* 7.19±0.59* 6.84±0.87*100 W組 21.36±4.24* 8.14±0.76* 8.72±1.17*

IFN-γ 蛋白主要在對照組大鼠卵巢細胞質中表達，少量在間質和黃體中表達；在不同光照組大鼠細胞質、黃體及間質中高表達，且隨著光照增強而增多。與對照組比較，60 W組、100 W組卵巢中IFN-γ 蛋白的表達顯著增加，差異有統計學意義（P＜0.05），而25 W組、40 W組與對照組的差異無統計學意義（P＞0.05）（圖2，表3）。

表3 各組大鼠卵巢組織TNF-α、IFN-γ 蛋白表達水平比較（±s）

表3 各組大鼠卵巢組織TNF-α、IFN-γ 蛋白表達水平比較（±s）

*P＜0.05 vs 對照組

組別 n TNF-α IFN-γ對照組 20 4.26±0.49 3.48±0.61 25 W組 19 5.14±0.53 4.56±0.43 40 W組 19 5.85±0.41 4.95±0.36 60 W組 18 8.78±0.58* 7.90±0.46*100 W組 19 9.68±0.84* 9.14±0.29*

圖1 TNF-α（A1～E1）和IFN-γ（A2～E2）在各組大鼠卵巢組織中的表達，免疫組織化學，×200

3 討論

應激在一定程度下會干擾機體正常的平衡狀態，機體會通過應激應答機制處理應激源（stressor）產生的刺激，以維護機體體內的動態平衡穩態[2]。長期的光照應激會在一定程度上影響大腦調控機體激素的功能，導致分泌激素水平下降，使得性腺軸（下丘腦-垂體-卵巢）負反饋調節受阻，導致垂體分泌的FSH和LH激素水平上升，其中以FSH的上升更為顯著[9]。不同強度的光照強度均可引起大鼠性激素水平的改變，且隨著光照強度以及時間的延長，對大鼠的影響也日益明顯。不同光照強度干預組大鼠的外周血中雌二醇激素水平相比于對照組顯著降低，可能的原因是不同光照強度影響下丘腦的分泌功能，從而影響垂體功能，進一步影響卵巢，造成機體性激素紊亂，影響大鼠卵池中各級卵泡的數量以及功能，造成卵巢儲備功能低下，影響大鼠卵巢功能[10]。不同光照強度干預組大鼠血清FSH、LH激素水平顯著高于對照組，一方面可能的原因是大鼠晚上長時間處于強光環境使性腺軸的正常分泌功能受到影響，另一方面可能是卵巢-垂體-下丘腦之間相互影響，通過負反饋機制作用，相互作用，造成大鼠體內激素（雌二醇、FSH、LH）的改變。激素FSH和LH會相互作用，并有助于卵泡的成熟及排卵、參加雌性激素的合成與分泌[11]。因此以上各個環節出現異常均可導致卵巢功能的失調。

有研究證實如果下調TNF-α 在大鼠血清含量及卵巢組織中的表達，有助于對卵巢起保護作用，減緩卵巢功能的下降[12]。IFN-γ 是具有多種免疫調節功能的免疫調節因子，其在生殖腺的主要研究集中在對卵巢衰老功能的作用上[13]。IFN-γ 在機體各級卵泡從卵池中發育到成熟卵泡、排卵以及閉鎖整個過程中均參與調節。Russell 等[15]報道卵泡閉鎖引起卵巢功能下降，IFN-γ 參與調節一系列與卵泡閉鎖有關的細胞因子。IFN-γ 蛋白在卵巢中表達的水平與FSH/LH值呈正相關，提示隨著卵巢組織中IFN-γ 蛋白表達的升高，卵巢儲備功能下降。另外，IFN-γ 蛋白可能與卵巢顆粒細胞損傷或凋亡有關，其會造成卵巢顆粒細胞的過度衰老及凋亡，進一步加快卵池中卵泡的閉鎖，從而造成機體的排卵障礙，引起機體卵巢早衰[14]。本研究結果顯示，與對照組比較，不同光照強度干預組TNF-α、IFN-γ 蛋白表達明顯升高，其中60 W 光照組、100 W 光照組TNF-α、IFN-γ 蛋白表達水平最高，提示隨著光照強度以及時間延長，TNF-α、IFN-γ 蛋白表達的升高可加快大鼠體內卵泡閉鎖甚至凋亡。

綜上所述，長期的慢性光照應激不僅能影響大鼠內分泌功能，引起大鼠內分泌紊亂，從而造成性激素水平的紊亂，而且能升高卵巢中的TNF-α、IFN-γ 蛋白表達，使其與性激素相互影響，引起卵巢功能下降，造成卵巢早衰。