驢乳對小鼠腸道菌群的影響

文/祝可昕 張 奇＊ 張 明 武麗輝

（1 北京城市學院生物醫藥學部；2 新疆玉昆侖天然食品工程有限公司；3 農業農村部農藥檢定所）

驢乳作為一種天然的食品資源，近年來已逐漸成為研究開發的熱點[1]。與其他奶源相比，驢乳是一種低脂肪、低膽固醇、高鈣、富硒、美容、抗衰老的天然乳品。《本草綱目》中對驢乳的描述為“氣味甘，冷利，無毒，熱頻飲之可治氣郁，解小兒熱毒，不生痘疹”[2]。

驢乳是接近人乳的天然乳[3]，具有抗氧化、增強人體免疫力等功能[4，5]，其營養價值遠優于牛乳與羊乳。在對驢乳的前期研究中發現，驢乳中必需氨基酸和一些特殊生理活性氨基酸的含量均高于牛乳[6]，且經發酵后活性氨基酸可顯著提升[7]。據報道，驢乳在抗炎等領域具備其特殊功效[8]。盡管維吾爾族經典土方表明，驢乳具備調理腸道功能，但尚缺乏系統科學研究數據支持。

本研究以抗生素致小鼠腸道菌群失調模型為實驗動物，以驢乳為微生態調節劑，低聚果糖為陽性對照物，平板計數法測定腸道中腸桿菌、乳酸菌的含量和比例變化，并通過16S rDNA擴增子測序技術，測定驢乳干預后模型動物腸道菌群豐度與變化，探索驢乳調理腸道功能的可能性。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

無特定病原體（SPF）級昆明（KM）小鼠20 只，雄性，體重18～22 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK（京）2016-0011]；鹽酸林可霉素（貨號：L8390）、頭孢唑啉鈉（貨號：C9680）、氨芐西林鈉（貨號：A8180），購于北京索萊寶科技有限公司；驢乳凍干粉由新疆玉昆侖天然食品工程有限公司提供；MC、VRBA培養基購于北京陸橋技術股份有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 腸道菌群失調動物模型的建立[9]

隨機選取15 只KM小鼠，無菌條件下采集其糞便，隨后灌服抗生素溶液（以無菌生理鹽水配制的鹽酸林可霉素、頭孢唑啉鈉及氨芐西林鈉的混合液，3 種抗生素的終濃度均為20 mg/mL），0.2 mL/只，每天2 次，連續3 天。收集灌胃小鼠糞便，采用平板計數法對乳酸菌和腸桿菌進行檢測，以乳酸菌菌落數顯著降低且降低程度高于腸桿菌為模型建立成功標準。

1.3 分組及干預

將抗生素處理的15 只小鼠隨機分為模型對照自然恢復組（A組，生理鹽水）、驢乳復原乳干預組（B組，固形物含量為9.6%驢乳復原乳）、低聚果糖陽性對照組（C組，100 mg/mL低聚果糖生理鹽水溶液）3 組，每組5 只，另選未經抗生素處理的5 只小鼠作為空白對照（D組），A、B、C組每天灌胃2次，0.2 mL/只/次，連續6 天。

1.4 糞便采集及微生物計數

于灌胃前（第0天）、灌胃3天后（第3天）和灌胃6 天后（第6天）在無菌條件下采集小鼠糞便，稀釋后分別涂布MC培養基和VRBA培養基平板，37 ℃培養48 h后，對乳酸菌和腸桿菌進行計數分析。

1.5 微生物區系分析

為了進一步證明驢乳對小鼠腸道紊亂模型腸道微生態的改善作用，在無菌條件下收集模型自然恢復組、空白對照組、低聚果糖陽性對照組以及驢乳干預組6 天后的試驗小鼠糞便，每組隨機選擇2 只小鼠糞便作為測序樣品，委托北京博云華康基因科技有限公司對糞便中的16S擴增子進行測序，并進行微生物菌群多樣性分析。

1.6 統計方法

以Excel對各組小鼠腸道菌群進行分析，計算（x±s），比較各組之間差異。

2 結果與討論

2.1 動物模型構建

無菌條件下收集15 只抗生素灌胃小鼠糞便，以平板計數法檢測灌胃前后糞便中的乳酸菌和腸桿菌的變化。與空白對照組相比，經抗生素灌胃后，小鼠腸道中乳酸菌與腸桿菌含量均顯著降低（p＜0.01），且抗生素灌胃小鼠糞便中乳酸菌含量降低更多，降低比例顯著高于腸桿菌，根據模型判斷標準，判斷模型建立成功（表1第0天）。

2.2 驢乳對乳酸菌和腸桿菌的影響

分別對第0天、第3天和第6天各組小鼠腸道菌群進行檢測。結果表明，經驢乳復原乳和低聚果糖干預后，小鼠腸道菌群中的乳酸菌與腸桿菌含量均顯著提升，6 天后，乳酸菌基本恢復至正常水平，而模型自然恢復組乳酸菌和腸桿菌的恢復均顯著低于低聚果糖陽性對照組和驢乳干預組（表1、圖1）。

表1 腸道紊亂模型構建及干預后腸道菌檢測[（x±s），lg CFU/g，n=5]

圖1 驢乳對小鼠腸道菌群影響

對8 只小鼠糞便進行16S擴增子測序，并分析其腸道微生物種類和豐度，結果如圖2所示。經驢乳復原乳和低聚果糖干預后，小鼠腸道菌群豐度顯著提升，與空白組相當，模型自然恢復組腸道菌群的豐度較低，說明驢乳具備顯著的改善腸道微生態功能。

進一步對微生物類型進行分析發現，經驢乳復原乳干預的小鼠，腸道菌群中的雙歧桿菌（Bifidobacterium sp.）、乳桿菌（Lactobacillus sp.）、阿克曼菌（Akkermansia sp.）等有益菌含量均高于模型自然恢復組；與抗過敏相關的多爾氏菌屬（Dorea sp.）豐度也顯著恢復；與改善動脈粥樣硬化相關的羅斯拜瑞氏菌（Roseburia sp.）也有效恢復[10]。同時，擬桿菌屬（Bacteroides sp.）、埃希氏菌屬（Escherichia sp.）等[11]條件致病菌含量降低。

圖2 腸道菌群區系分析

3 討論

本研究根據文獻報道進行致腸道紊亂的抗生素類型的選擇[9]，同時調整抗生素終濃度至20 mg/mL，灌胃KM小鼠，建立腸道菌群紊亂小鼠模型。經檢測，灌胃小鼠糞便中腸桿菌與乳酸菌均由1×108CFU/g降至約1×104CFU/g，且乳酸菌下降更多，含量低于腸桿菌，適合于腸道微生態干預恢復研究。

由模型構建可知，抗生素對腸道菌群影響巨大，尤其對益生菌破壞嚴重，直接影響腸道功能與機體健康。通過本研究，發現驢乳具有顯著的促進腸道菌群恢復功能，經驢乳復原乳干預后的小鼠腸道菌群豐度顯著提升，與正常空白對照組相當，且對機體有益的菌種含量恢復明顯，比例提升，即服用驢乳對改善因服用抗生素導致的腸道功能紊亂具有促進作用。

此外，本研究通過16S擴增子測序分析，發現了一些與健康有關的微生物如Roseburia sp.含量的提升。據報道，腸道中擁有Roseburia sp.的小鼠，與沒有該菌的普通小鼠相比，患動脈粥樣硬化的幾率明顯下降，且炎癥發生更少[10]。

4 小結

本研究采用抗生素灌胃構建小鼠腸道紊亂模型，隨后以驢乳復原乳干預，采用平板計數法和16S擴增子測序法探索小鼠腸道菌群變化。結果發現，經驢乳復原乳干預后的模型小鼠腸道菌群豐度顯著提升，與模型自然恢復組相比，乳酸菌恢復更快，益生菌比例提高，條件致病菌含量較低。由此可見，驢乳可有效改善小鼠腸道菌群，促進腸道健康。