運動訓練對輕度認知功能障礙模型小鼠學習記憶能力減退及海馬組織病理學改變的影響

方 侃，呂光輝，汪新體，艾志兵，王啟斌

隨著我國人口老齡化進程的加劇，阿爾茨海默病(alzheimer's disease, AD)已成為嚴重危害中老年人心身健康的公共衛生問題；其發病機制不明，亦無有效治療藥物。輕度認知功能障礙(mild cognitive impairment, MCI)是介于正常衰老和癡呆之間的一種不穩定的臨床狀態；其既有認知功能的可逆性，又可以逐漸加重并最終發展為AD。65歲以上MCI患者AD的發病率為10%～15%。因此，正確認識和有效干預MCI對早期防治AD具有重要意義[1-5]。目前在MCI動物模型的研究中存在3個問題[6-9]：一是完全沿襲AD的造模過程，以至于不能準確把握MCI的病理生理階段；二是制模因素單一、過程偏短，只是在一個點或一個局部表達MCI的急性病理變化；三是認知功能障礙的可逆性無法驗證。因此，必須嘗試建立具有臨床MCI特征的動物模型以探索該病的病因、發病機制及有效干預措施。衡量MCI動物模型的是表面效度(類似人MCI行為表現)、結構效度(類似人MCI病理學改變)及預測效度(模型行為學改變可逆轉)。有氧運動可以通過多種機制有效減緩癡呆患者的認知障礙速度[10-13]。本研究采用D-半乳糖(D-galactose, D-gal)、三氯化鋁和亞硝酸鈉聯合作用構建MCI小鼠模型，觀察了運動訓練對MCI模型小鼠學習記憶能力減退及海馬組織病理學改變的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 選取雄性昆明小鼠90只，16月齡，體重50～55 g，SPF級，由湖北醫藥學院實驗動物中心提供，實驗動物合格證號[SYXK(鄂)2016-0031]，生產許可證號：SCXK(鄂)2016-0008。適應性喂養1周，自由飲食，光照12 h/d，室溫(22±2)℃，濕度(50～60)%。本項目經學醫院醫學倫理委員審查批準。

1.2主要實驗儀器及試劑 SA101小動物跑臺(江蘇賽昂斯公司)；MT-200水迷宮行為學跟蹤系統(成都泰盟公司)；D-gal(美國Amresco公司)；膽堿乙酰轉移酶(choline acetyltransferase, ChAT)、乙酰膽堿酯酶(acetylcholine esterase, AchE)、β-淀粉樣蛋白42(amyloid beta 42, Aβ42)、酶聯免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒均購自美國elabscience公司，改良Bielschowsky神經染色液(武漢卡諾斯公司)，熱電Multiskan MK3全自動酶標儀(美國)。

1.3實驗方法

1.3.1動物分組及MCI小鼠模型復制：將90只小鼠按數字表法隨機分為對照組、MCI模型組、運動干預組，每組30只。MCI模型組、運動干預組小鼠給予100 g/L的D-gal(500 mg/kg)、9 g/L的亞硝酸鈉(45 mg/kg)，頸背部皮下注射；同時給予三氯化鋁(40 mg/kg)灌胃；連續3周。對照組以相同給藥方式給予等量無菌生理鹽水。

1.3.2跑臺運動干預：對運動干預組實施中等強度有氧運動干預。①適應性跑臺訓練：第1天運動速度為每分鐘12 m，訓練時間為20 min；隨后運動速度不變、訓練時間每天增加10 min，直至60 min/d，共5 d。②正式訓練：坡度為0°，第1周運動速度設定為每分鐘15 m，以后每1周增加運動速度(每分鐘增加3 m)，直至每分鐘24 m；每天訓練60 min，每周連續訓練5 d，共訓練3周。

1.4檢測指標及方法

1.4.1行為學測試：①定位航行實驗：記錄3組大鼠找到平臺所用的時間(逃避潛伏期)；若>60 s未找到平臺則計逃避潛伏期為60 s；連續5 d。②空間探索實驗：定位航行實驗結束后次日撤除平臺，記錄3組大鼠第1次穿越原平臺位置時間及在目標象限活動時間。

1.4.2海馬取材、固定：水迷宮實驗結束后，斷頭取腦，迅速分離并取下海馬組織。取3組小鼠一側海馬組織(左側或右側，隨機)裝入EP管，投入液氮中，用于ELISA等檢測；另一側海馬組織投入4%的多聚甲醛溶液中固定過夜，用于染色標本的制作。

1.4.3海馬勻漿ChAT、AchE活性及Aβ42含量測定：從液氮中取出海馬組織，平衡溫度后稱重，按質量/體積比(1∶9)加入4℃生理鹽水勻漿。勻漿液置于離心機(轉速3000 r/min、半徑13.5 cm)中離心15 min，取上清分裝于EP管，置于-20℃冰箱待測。按試劑盒說明，用ELISA檢測海馬勻漿中ChAT、AchE活性及Aβ42含量。

1.4.4海馬切片制備及染色：將海馬組織在多聚甲醛中過夜，于次日行石蠟包埋，制作石蠟切片，連續冠狀位切片，厚度為10 μm。一部分切片做HE染色；另一部分切片按照改良Bielschowsky神經染色液說明書進行銀染：將切片浸染于銀溶液中，之后用還原劑處理，使神經元、軸突及神經纖維呈現深棕色或黑色。

2 結果

2.1小鼠學習記憶能力比較 與對照組相比，MCI模型組小鼠逃避潛伏期、第1次穿越原平臺位置時間延長，在目標象限活動時間縮短，差異均有統計學意義(P<0.05)。與MCI模型組比較，運動干預組逃避潛伏期、第1次穿越原平臺位置時間縮短，在目標象限活動時間延長，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組小鼠學習記憶能力比較

2.2小鼠海馬勻漿ChAT、AchE活性及Aβ42含量比較 與對照組比較，MCI模型組海馬ChAT表達水平明顯降低，而AchE、Aβ42表達水平明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。與MCI模型組比較，運動干預組海馬ChAT表達水平明顯升高，而AchE、Aβ42表達水平明顯降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組小鼠腦勻漿ChAT、AchE活性及Aβ42含量比較

2.3小鼠海馬組織病理學改變 對照組海馬CA1區錐體細胞結構清晰，神經纖維排列整齊。MCI模型組海馬CA1區錐體細胞密度下降，部分細胞核固縮、深染，可見少量的細胞凋亡，神經纖維排列稍稀疏。運動干預組海馬CA1區錐體細胞密度增加，細胞結構及神經纖維排列清晰、有序，未見凋亡細胞。見圖1。

圖1 3組小鼠海馬組織病理學改變(HE×400，15個)

2.4小鼠海馬神經元纖維和Aβ斑的形態比較 對照組海馬CA1區錐體細胞排列整齊，其神經元纖維清晰、規則、呈棕黑色，且伸入細胞突起內；細胞外未見Aβ斑。MCI模型組海馬CA1區錐體細胞稍稀疏，部分細胞出現核固縮，細胞神經元纖維稍增粗、模糊；細胞外未見Aβ斑。運動干預組海馬CA1區錐體細胞排列有序，細胞神經元纖維清晰；細胞外未見Aβ斑。見圖2。

圖2 3組小鼠海馬神經元纖維和Aβ斑病理形態(Bielschowsky×400，15個)

3 討論

隨著我國老齡化進程的加劇，AD已成為危害老年人身心健康的嚴重社會公共問題；AD發病機制不明，尚無有效藥物和治療技術[14-15]。目前基于Aβ毒性學說開發的抗AD藥物在臨床三期試驗中失敗，讓更多研究團隊將注意力投入到探索MCI干預途徑和機制上，試圖從源頭上防治AD。

D-gal是一種還原糖，在正常濃度狀態下代謝生成葡萄糖，而高劑量時形成活性氧簇如超氧陰離子、羥自由基、過氧化氫等及高級糖化終末產物，通過氧化應激等機制，產生神經毒性效應，引起海馬神經元退行性病變[16-17]。鋁是一種慢性神經毒素，三氯化鋁除介導脂質過氧化外，還可以引起腦組織神經元纖維變性、β-淀粉樣蛋白的過表達[18]。亞硝酸鈉的氧化性導致血紅蛋白失去攜氧輸氧功能，使腦組織產生缺氧性中毒。本課題組前期研究表明，D-gal、亞硝酸鈉和三氯化鋁三者復合慢性作用是建立AD動物模型的比較理想的方法[8-9,19]。

本研究結果顯示，與對照組比較，MCI模型組逃避潛伏期、第1次穿越原平臺位置時間延長，在目標象限活動時間縮短；海馬ChAT水平明顯降低，而AchE、Aβ42水平明顯升高；MCI模型組海馬CA1區錐體細胞密度下降，部分細胞核固縮、深染，少量細胞凋亡，神經纖維也排列稍稀疏；銀染示MCI模型組海馬CA1區錐體細胞稍稀疏，部分細胞出現核固縮，細胞神經元纖維稍增粗、模糊；細胞外未見Aβ斑。與劉梅訊和孫天敏[8]、陳婷[9]報道結果一致，出現了輕度學習記憶損害、輕度膽堿能系統受損、輕度APP/Aβ代謝紊亂及輕度神經病理學變化，即“四輕”效度變化，由此判斷MCI小鼠模型復制成功一致?！八妮p”效度變化是MCI模型的特征，因此區別了AD模型；如MCI模型組小鼠海馬勻漿Aβ42水平明顯升高，但在海馬區細胞外未發現Aβ斑。

本研究結果顯示，與MCI模型組比較，運動干預組小鼠逃避潛伏期、第1次穿越原平臺位置時間縮短，在目標象限活動時間延長；海馬ChAT表達水平明顯升高，而AchE、Aβ42表達水平明顯降低；HE染色，運動干預組海馬CA1區錐體細胞密度增加，細胞結構及神經纖維清晰、有序，未見凋亡細胞；銀染示運動干預組海馬CA1區錐體細胞排列有序，細胞神經元纖維清晰；與既往文獻結果一致。提示運動干預可以逆轉MCI模型小鼠的“四輕”效度變化，其可能機制是：運動訓練不僅可以改善大腦皮質和海馬組織的血液循環，而且還可以拮抗炎癥反應，增加海馬結構腦源性神經營養因子表達，誘導海馬神經發生改變，從而改善海馬區病理學改變，提高MCI模型小鼠的認知功能[19-22]。

綜上所述，本研究采用D-gal、三氯化鋁和亞硝酸鈉三者聯合對老年小鼠給藥3周，復制了小鼠MCI“四輕”效度變化，構建了MCI小鼠模型；并對MCI模型小鼠實施3周跑臺運動干預，基本逆轉了MCI模型小鼠的“四輕”效度變化。這表明，運動訓練可以明顯改善MCI模型小鼠海馬組織的病理學改變，從而提高其學習記憶能力。