丙泊酚對七氟烷引起的大鼠海馬神經細胞凋亡及認知障礙的影響及相關機制探究

肖秀英，吳華兵，詹瑋瑋

大腦海馬是大腦中樞神經系統中最復雜的部位[1]。海馬神經元主要由海馬神經細胞構成，當海馬神經細胞受損后會引起記憶功能減退、學習能力降低、認知發生障礙等癥狀[2]。隨著現代醫療技術的發展，麻醉在各種手術中扮演著重要角色，其中七氟烷是目前臨床上使用較為廣泛的吸入類麻醉劑[3]。既往研究顯示，七氟烷對中樞神經系統的發育、學習和記憶功能都有潛在損傷，吸入量過多會嚴重影響海馬神經細胞并導致其凋亡[4]。丙泊酚是一種臨床常用的靜脈麻醉藥，多用于腫瘤切除手術的麻醉[5]。丙泊酚可以減輕七氟烷帶來的應激反應；同時可以通過調節核因子-κB(NF-κB)通路和炎癥反應因子活性，對心腦血管起到保護作用[6]。目前有關丙泊酚治療七氟烷引起大鼠海馬神經細胞損傷及認知障礙的相關機制尚不完全統一。本文旨在探究丙泊酚對七氟烷引起大鼠海馬神經細胞損傷及認知障礙的相關機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 SPF級雄性SD大鼠60只，3周齡，體重(200±15)g，均由廣東醫學院實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：粵監證字2004A029號。本實驗遵循動物實驗3-R原則同時已獲得動物倫理委員會批準。適應性喂養1 周，隨機分為對照組、七氟烷組、聯合組，每組20只。

1.2實驗藥物與試劑 丙泊酚注射液(四川國瑞藥業有限責任公司，國藥準字H20030115)；Bax、Bcl-2、Caspase-3抗體均購自Santa Cruze Biotechnology 公司；HRP羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG等二抗購自美國Thermo公司；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自四季青公司；白介素-6(interleukin-6, IL-6)、IL-1β、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)試劑盒子購自美國Sigma公司。

1.3實驗儀器 生化分析儀(型號：Sysmex-chemix-180)購自日本Furuno Electric公司；電子天平(型號：BS-124s)購自北京賽多斯儀器系統有限公司；正置型金相顯微鏡(型號：SG-51)購自上海光學儀器廠；蛋白電泳及轉膜儀購自Bio-Rad公司；凝膠成像系統購于以色列DNR公司；LD-66實驗室切片機購自長沙益廣制藥機械公司。流式細胞儀(型號：CytoFLEX)購自美國Beckman公司。

1.4藥物干預方法 七氟烷組每天吸入1.5%七氟烷1 h；聯合組在七氟烷組基礎上加用丙泊酚注射液150 mg/kg；對照組給予等量生理鹽水。3組均給藥14 d。

1.5觀察指標

1.5.1大鼠神經功能檢測：3組均于藥物干預24 h后，分別使用Y-迷宮實驗及Longa評分法評價大鼠神經功能[7]。①Y-迷宮實驗：在Y-迷宮中控制儀釋放電擊電壓為70 V、延遲2 s的電刺激來電擊大鼠足部。控制儀中的反射箱頂端有3有個信號燈，根據燈光信號電擊大鼠，讓大鼠逃離至安全區域。記錄各組錯誤反應次數和逃離時間。②Longa評分法：評分為5個等級，0分為正常，大鼠無神經功能缺損；1分為大鼠左側前爪不能完全伸展；2分為大鼠行走時向左側旋轉；3分為大鼠行走時向左側傾；4分為大鼠不能自發行走。評分越高提示大鼠神經功能缺損越嚴重。

1.5.2蛋白免疫印跡法檢測相關蛋白表達水平：3組完成神經功能檢測后，將大鼠使用斷脖法處死，取其大腦海馬區組織，剪碎后用胰蛋白酶消化，提取總蛋白并轉移到PVDF膜，常規封閉2 h后加入各需要檢測蛋白的一抗、二抗，并孵育，本研究使用的內參蛋白為β-actin，采用顯色液顯色后行吸光度分析，計算各蛋白相對表達量。

1.5.3細胞凋亡檢測：取3組大鼠的海馬區組織，使用胰蛋白酶消化為單層細胞離心，4℃、離心5 min；收集細胞后加入Binding Buffer重懸細胞100 μl、Annexin V-FITC 5 μl、PI 5 μl，避光孵育后加入Binding Buffer；采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.5.4血清炎性因子檢測：斷脖法處死大鼠后，取其血液離心，1500 r/min、離心15 min，取去上清液后的沉淀，按照試劑盒操作方法檢測IL-6、TNF-α、IL-1β含量。

2 結果

2.1大鼠神經功能比較 與對照組相比，七氟烷組逃離時間、錯誤反應次數和Longa評分顯著升高(P<0.05)。與七氟烷組相比，聯合組逃離時間、錯誤反應次數和神經功能評分顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 3組大鼠神經功能檢測比較

2.2大鼠海馬區細胞凋亡情況比較 3組海馬區細胞凋亡率分別為：對照組(7.58±0.29)%、七氟烷組(31.69±2.35)%、聯合組(15.21±1.03)%。與對照組相比，七氟烷組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與七氟烷組相比，聯合組細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖1。

圖1 3組大鼠海馬區細胞凋亡情況比較

2.3大鼠海馬區凋亡蛋白表達比較 與對照組相比，七氟烷組Bax蛋白和Caspase-3蛋白相對表達水平顯著升高，Bcl-2蛋白相對表達水平顯著降低(P<0.05)。與七氟烷組相比，聯合組Bax蛋白和Caspase-3蛋白相對表達水平顯著降低，Bcl-2蛋白相對表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖2、表2。

圖2 3組大鼠海馬區Bax、Caspase-3、Bcl-2蛋白表達情況

表2 3組大鼠Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白相對表達量比較

2.4大鼠血清炎性因子比較 與對照組比較，七氟烷組血清IL-6、IL-1β和TNF-α含量顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與七氟烷組比較，聯合組大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α含量顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 3組大鼠IL-6、IL-1β和TNF-α含量比較

3 討論

吸入七氟烷與記憶損傷程度密切相關，吸入七氟烷會對海馬CA1區錐體神經元電壓門控通道有影響[8]；也會在腦發育過程中對海馬CA1 區錐體神經元電壓門控通道產生抑制作用，找到減少七氟烷麻醉帶來的認知功能障礙和海馬神經細胞凋亡一直是麻醉學研究的難點和熱點。丙泊酚作為一種靜脈全身麻醉藥被廣泛應用，其腦保護作用也有較多研究[9-10]。本研究結果顯示，與七氟烷組相比，聯合組大鼠逃離時間、錯誤反應次數和Longa評分顯著降低，說明對于七氟烷引起大鼠海馬神經細胞損傷模型，丙泊酚可使大鼠神經功能和記憶功能得到有效改善。與王潔和王建華[11]報道的丙泊酚麻醉可有效降低患者術后認知障礙發生率的結論一致。

海馬神經細胞凋亡是引起大鼠神經功能受損的重要因素之一[12]，而細胞凋亡受各種基因調控。目前研究較多的基因包括Caspase家族和Bcl-2家族基因，Caspase家族中Caspase-3和caspase-9等是Caspase最常見的凋亡因子[13]。Caspase-9主要作用是通過自身裂解使得proCaspase-3 產生有活性的Caspase-3，引起細胞凋亡的級聯反應，最終導致細胞凋亡。除了Caspase家族蛋白可以調控細胞凋亡外，Bcl-2家族的Bcl-2蛋白和Bax蛋白也可以調控細胞的凋亡[14-15]。本研究結果顯示，與七氟烷組相比，聯合組大鼠海馬區細胞凋亡率顯著降低；說明丙泊可以明顯降低海馬區細胞的凋亡水平。本研究結果同時顯示，與七氟烷組相比，聯合組Bax蛋白和Caspase-3蛋白相對表達水平顯著降低，Bcl-2蛋白相對表達水平顯著升高。說明丙泊酚可以升高抑制凋亡蛋白的表達水平，抑制海馬細胞凋亡，從而使大鼠的神經功能得到顯著的改善。與胡洪憑等[16]報道的丙泊酚通過激活相關信號通路抑制神經細胞凋亡結論一致。

大鼠海馬組織受到損傷后會引發炎癥反應，可使Th1細胞分泌促炎性細胞因子，主要為TNF-α、IL-1β、IL-6 和IL-8等[17-18]。本研究結果顯示，與七氟烷組相比，聯合組大鼠血清IL-6、IL-1β和TNF-α水平顯著降低。這可能與丙泊酚可使NF-κB和NLRP3炎性體激活，抑制炎癥反應，從而保護大鼠海馬區細胞有關；與于文娟等[19]報道一致，該研究認為丙泊酚可抑制炎癥反應，影響大鼠認知功能。

綜上所述，丙泊酚可以緩解七氟烷引起大鼠海馬神經細胞損傷，其作用機制與抑制海馬細胞凋亡和炎癥反應相關。