膀胱癌組織中LncRNA DDX11-AS1與LAMB3表達及臨床意義

吳 芳，王 璨，譚 智，張雨相，易小明

膀胱癌是泌尿生殖系統常見的惡性腫瘤，全球范圍內，每年發病例數達43萬，占據所有惡性腫瘤的第11位，年齡標化病死率達4.6/100 000[1]。膀胱癌的臨床治療方式包括手術治療、化療、放射治療及生物治療等；但因膀胱癌腫瘤的異質性較大，復發率高，對于肌層浸潤性膀胱癌更易出現局部浸潤及遠處轉移，此類患者遠期生存預后不佳[2]。因而有必要深入研究其分子機制，尋找新的診斷治療靶點。長鏈非編碼RNA(long-noncoding RNA, LncRNA)DDX11-AS1，位于12p11.21，又稱為內聚調節劑非編碼RNA，在胃癌、肝癌及乳腺癌等腫瘤中均存在異常表達的現象[3-4]。研究發現，LncRNA DDX11-AS1廣泛參與真核生物多種細胞中基因轉錄激活，通過促進下游如緊密連接蛋白7基因的表達，促進腫瘤細胞的增殖轉移及化療耐藥性的產生[5]。層黏連蛋白亞基α3(laminin subunit alpha 3, LAMα3)基因位于1q32.2，該基因編碼產物屬于基底膜蛋白家族。LAMB3蛋白是層黏連蛋白β亞基，與α和γ亞基一起形成層黏連蛋白5。LAMB3廣泛參與許多生物過程，如細胞黏附、遷移及與其他細胞外基質成分的相互作用。研究表明，LAMB3在甲狀腺癌、甲狀腺乳頭狀癌、肝細胞癌和胰腺癌的發生和發展中起著重要作用[6-7]。但LAMB3在膀胱癌中的潛在調控機制及臨床意義尚不清楚。本研究通過免疫組化方法檢測了膀胱癌的癌組織中LncRNA DDX11-AS1及LAMB3 mRNA和蛋白表達水平，初步探討兩者的表達與臨床病理特征的關系及臨床意義。

1 資料與方法

1.1臨床資料 回顧性分析2015年2月—2016年2月我院診治并行手術治療的84例膀胱癌患者的臨床病理資料。①納入標準：初次發現；病理學檢查確診為膀胱移行細胞癌；無其他腫瘤病史；既往無手術、放化療等腫瘤治療史；所有患者對本研究知情同意并簽字。②排除標準：合并間質性膀胱炎、膀胱炎等疾病；伴有嚴重心肺等臟器功能障礙；合并自身免疫系統疾病或精神障礙性疾病。男51例，女33例；年齡31～77(48.3±7.2)歲；病理分級：高分化35例，中低分化49例；腫瘤分期：Ⅰ～Ⅱ期54例，Ⅲ～Ⅳ期30例；肌層浸潤48例，非肌層浸潤36例；腫瘤直徑≤3 cm者44例，直徑>3cm者40例；伴淋巴結轉移29例，無淋巴結轉移55例。本研究經我院倫理委員會審核批準通過。

1.2膀胱癌組織中LAMB3蛋白表達 采用免疫組織化學法檢測，將組織用10%中性甲醛固定，石蠟包埋切片，切片70℃、烤片2 h；二甲苯脫蠟2遍，梯度水化；高壓鍋法抗原熱修復：3%過氧化氫去除內源性過氧化物酶；5%羊血清，室溫封閉30 min；滴加足夠量的稀釋好的一抗(LAMB3稀釋比1∶500)，4℃孵育過夜，LAMB3抗體購自Abcam公司，貨號ab97765。二抗室溫孵育2 h；DAB顯色5 min；蘇木精復染1 min，鹽酸乙醇分化；梯度脫水，封片鏡檢。染色結果判定：根據陽性表達部位的染色強度及細胞數對蛋白表達進行評估。胞質不著色為0分，顏色淺為1分，棕黃色顆粒為2分，顏色深為3分。無染色細胞為0分，陽性細胞數<25%為1分，25%～50%為2分，>50%為3分。結果以染色強度評分與陽性細胞數評分的乘積計算，0～2分判定為陰性，3～9分判定為陽性。

1.3隨訪 所有納入者自出院起開始隨訪，采用電話方式或者門診隨訪方式進行，隨訪內容為患者生存情況，每月隨訪1次，總隨訪時間5年。計算5年總體生存率(overall survival, OS)。隨訪截止日期為隨訪時間結束或患者出現死亡。

2 結果

2.1LncRNA DDX11-AS1及LAMB3 mRNA表達比較 膀胱癌癌組織中LncRNA DDX11-AS1的相對表達量為0.685±0.114，癌旁組織為0.121±0.022。癌組織中LncRNA DDX11-AS1的相對表達量顯著高于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.01)。膀胱癌癌組織中LAMB3 mRNA的相對表達量為0.835±0.121，癌旁組織為0.220±0.053，癌組織中LAMB3 mRNA的相對表達量顯著高于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖1。

圖1 膀胱癌患者癌組織和癌旁組織中LncRNA DDX11-AS1及LAMB3 mRNA表達情況比較

2.2癌組織與癌旁組織中LAMB3蛋白表達比較 LAMB3棕黃色陽性表達主要位于細胞質，少量表達于細胞膜。癌組織與癌旁組織中LAMB3蛋白表達陽性表達率分別為72.619%(61/84)、17.857%(15/84)。癌組織中LAMB3蛋白表達的陽性率顯著高于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖2。

圖2 膀胱癌患者癌組織及癌旁組織中LAMB3蛋白表達情況(SP×400)

2.3癌組織中LncRNA DDX11-AS1及LAMB3表達與臨床病理特征的關系 膀胱癌癌組織中LncRNA DDX11-AS1與LAMB3表達與腫瘤TNM分期、是否合并淋巴結轉移有關(P<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤大小、浸潤深度及病理分級無關(P>0.05)。TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、伴淋巴結轉移的膀胱癌患者癌組織中LncRNA DDX11-AS1及LAMB3 mRNA表達高于TNM分期I～Ⅱ期、無淋巴結轉移癌組織的膀胱癌患者(P<0.05)。見表1。

表1 膀胱癌患者癌組織中LncRNA DDX11-AS1、LAMB3表達與臨床病理特征的關系

2.4癌組織中LncRNA DDX11-AS1與LAMB3表達的相關性 膀胱癌患者癌組織中 LncRNA DDX11-AS1表達與LAMB3表達呈顯著正相關(r=0.564，P<0.01)。見圖3。

2.5不同LncRNA DDX11-AS1、LAMB3表達患者生存預后比較 84例膀胱癌患者的5年OS為65.476%(55/84)。LncRNA DDX11-AS1高表達組44例，5年OS為54.545%(24/44)；LncRNA DDX11-AS1低表達組40例，5年OS為77.50%(31/40)。與LncRNA DDX11-AS1低表達組相比，LncRNA DDX11-AS1高表達組預后差(P<0.05)。LAMB3高表達組41例，5年OS為46.341%(19/41)；LAMB3低表達組43例，5年OS為83.721%(36/43)。LAMB3高表達組預后較LAMB3低性表達組預后差(P<0.05)。見圖4。

圖4 不同LncRNA DDX11-AS1、LAMB3表達的膀胱癌患者生存預后比較

3 討論

我國膀胱癌的發病率為7.49/100 000，約占我國惡性腫瘤發病構成2.50%；多數患者確診時已為中晚期，雖然給予積極手術、化療等綜合治療，但仍有部分膀胱癌患者術后出現腫瘤復發或進展，影響其長期生存[8]。因此，研究膀胱癌的發病機制并尋找新的診斷治療靶點具有重要臨床意義。非編碼RNA是一類無蛋白質編碼功能的RNA調控分子。可分為微小RNA、lncRNA及環狀RNA等。以往認為非編碼RNA是細胞內轉錄過程中的“垃圾”，但目前大量研究表明非編碼RNA在細胞分化發育、代謝及衰老等過程中均發揮重要的調控作用[9]。

LncRNA DDX11-AS1是近年來研究發現的參與真核生物中多種細胞中基因轉錄激活的非編碼RNA分子。研究表明，腫瘤中LncRNA DDX11-AS1能夠通過表觀遺傳學修飾影響癌基因的轉錄，促進腫瘤細胞的無限增殖、代謝重編程及轉移等行為，檢測腫瘤中LncRNA DDX11-AS1的表達有利于判斷患者預后生存時間[10]。本研究結果顯示，癌組織中LncRNA DDX11-AS1的表達上調；其表達上調的機制尚不清楚，可能與腫瘤發生時轉錄調控異常有關。研究表明，腫瘤中促進LncRNA DDX11-AS1表達的轉錄因子YY1表達升高，其能結合到啟動子區，促進LncRNA DDX11-AS1的表達[5]。本研究結果顯示，膀胱癌癌組織中LncRNA DDX11-AS1的表達與腫瘤TNM分期、是否合并淋巴結轉移有關，腫瘤分期越高、伴有淋巴結轉移的患者癌組織中LncRNA DDX11-AS1表達水平較高。表明LncRNA DDX11-AS1的表達能促進膀胱癌的發生發展；分析其原因可能為LncRNA DDX11-AS1作為分子海綿，結合并抑制微小RNA326等，進而導致AKT信號通路的過度激活，AKT促進癌基因如血管內皮生長因子、血小板源生長因子受體等表達，促進腫瘤細胞的增殖及淋巴結轉移[3，11]。有學者通過大規模RNA測序分析發現，肝癌中LncRNA DDX11-AS1異常表達，與患者不良預后密切相關[12]。本研究通過分析LncRNA DDX11-AS1表達與患者生存預后的關系，發現高表達LncRNA DDX11-AS1的膀胱癌患者5年OS較低，表明膀胱癌組織中LncRNA DDX11-AS1的表達促進膀胱癌的進展，檢測癌組織中LncRNA DDX11-AS1的表達有可能成為判斷預后的標志物，并可能成為新的治療靶點。

LAMB3是層黏連蛋白家族的成員，是基底層的重要的生物活性成分，具有調控細胞的分化、遷移、黏附、增殖和存活等生物學功能。研究表明，LAMB3參與促進多種惡性腫瘤的進展，影響宮頸癌、頭頸部鱗癌等惡性腫瘤的侵襲和轉移能力[13-14]。本研究結果顯示，膀胱癌癌組織中LAMB3 mRNA的相對表達量及蛋白的陽性表達率均明顯高于癌旁組織組，表明癌組織中LAMB3表達上調。其機制可能是LAMB3的轉錄后調控異常有關。研究表明，微小RNA-24-3p能夠結合于LAMB3 mRNA的3'非編碼區，降低LAMB3 mRNA的穩定性。而腫瘤發生時微小RNA-24-3p表達下調，導致LAMB3表達增加[15]。本研究亦表明，腫瘤分期Ⅲ～Ⅳ期及伴淋巴結轉移患者的癌組織LAMB3表達明顯較高，提示LAMB3促進膀胱癌的發生發展。研究表明，LAMB3表達上調能夠促進腫瘤細胞中上皮間質轉化相關轉錄因子Slug等的表達，促進間質性表型如波形蛋白等的表達，而上皮性表型如E鈣黏素表達下調，腫瘤細胞的侵襲能力增強，促進腫瘤細胞的浸潤及轉移，導致腫瘤分期升高[16-17]。此外，高表達LAMB3患者5年OS明顯較低，表明癌組織中LAMB3的高表達可能導致膀胱癌的發生發展，有望成為評價預后的腫瘤標志物。本研究結果顯示癌組織中LncRNA DDX11-AS1的表達與LAMB3的表達呈明顯正相關。目前兩者之間相互作用關系尚不清楚，可能是LncRNA DDX11-AS1可作為內源性競爭性RNA結合并抑制微小RNA-2355的表達，引起微小RNA-2355下游靶基因LAMB3水平升高[18]。因此，兩者均可能是膀胱癌發生發展過程中重要標志物，但具體作用機制及臨床意義有待深入研究。

綜上所述，膀胱癌患者癌組織中LncRNA DDX11-AS1、LAMB3表達上調，且癌組織中LncRNA DDX11-AS1、LAMB3表達水平與腫瘤分期、淋巴結轉移有關，LncRNA DDX11-AS1、LAMB3參與膀胱癌的發生發展，有望成為膀胱癌的新腫瘤標志物。