輻照滅菌對桃紅丸主要成分的影響

李云霞，劉旭梅，王 寧，周 娜，劉建芳，王文習

桃紅丸為我院開發的非標準制劑(制劑許可證號：總制字2016F202004)，具有活血化瘀、調經止痛的功效，在治療關節炎、月經不調、冠心病、皮膚色斑方面療效顯著[1-4]。桃紅丸由桃仁、紅花、當歸、川芎、赤芍等9味藥組成，其中桃仁、紅花為君藥，是活血化瘀方劑中的經典組合。桃仁中主要含有各種脂肪酸、不飽和脂肪酸、甾醇及糖苷類，黃酮類化合物等[5]；紅花主要含色素、黃酮類化合物，生物堿類，其中羥基紅花黃色為最主要的有效成分[6-9]；當歸、川芎、赤芍為臣藥，主要的有效化學成分有芍藥苷和阿魏酸、川芎內酯等[10]。由于處方中含有原藥材粉末，現有的滅菌工藝有時不能達到微生物限度檢查要求，需要60Co-γ輻照滅菌處理。

20世紀70年代以來，60Co-γ輻照滅菌在全世界廣泛展開，由于其穿透力強、使用方便、省時省力、價廉、節能等特點，且在常溫下就可達到理想的滅菌效果[11-13]。近年來輻照滅菌技術被廣泛應用于醫藥食品行業、農業、工業生產等，中藥制劑領域也開始普遍使用60Co-γ射線輻照滅菌[14-19]，尤其是對易揮發、熱敏感的中藥材及蜜丸的滅菌，更能體現出其優越性[20]。本研究通過建立輻照前后桃紅丸的高效液相色譜(HPLC)指紋圖譜，同時選取測定該制劑中的3種有效成分羥基紅花黃色素A、芍藥苷和阿魏酸在輻照前后的含量變化，考察輻射滅菌對桃紅丸的影響，為輻照滅菌技術在中藥制劑中應用提供科學依據。現報告如下。

1 儀器與試藥

1.1試驗儀器 安捷倫1100高效液相色譜儀(G1322型在線脫氣機、G1311A型二元泵、G1313A型自動進樣器、G1315B二極管陣列檢測器、A.08化學工作站，美國Agilent公司)，BT214D型、BT125D型分析天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)，雷磁PHS-3C型酸度計(上海儀電科學儀器股份有限公司)，KQ-250B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試驗藥品 乙腈為色譜純(天津市康科德科技有限公司)；85%磷酸；甲醇為分析純；水為超純水。阿魏酸對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110773-201313；純度以99.6%計)；芍藥苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110736-200630，純度以95.7%計)；羥基紅花黃色素A對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：111637-301308)。桃紅丸(批號：20180320)，桃紅丸(批號：20180320，輻照劑量8 kGy)。

2 方法與結果

2.1色譜條件 色譜柱為Shimadzu VP-ODS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫為室溫，流速1 ml/min；檢測波長230 nm。以乙腈為流動相A，磷酸溶液(pH 2.6)為流動相B，梯度洗脫(0～20 min，95%～78% B；20～35 min，78%～70% B；35～45 min，70%～60% B；45～50 min，60%～25% B；50～51 min，25%～95% B)；平衡時間為10 min；進樣量為20 μl。

2.2溶液制備

2.2.1對照品儲備液的制備：精密稱定羥基紅花黃色素A、阿魏酸對照品各約10 mg，分別置100 ml量瓶中，精密稱定芍藥苷對照品約25 mg，置25 ml量瓶中，分別加入適量50%甲醇，超聲處理2 min使其溶解，放至室溫，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，獲得每1 ml含羥基紅花黃色素0.1 mg、阿魏酸0.1 mg和芍藥苷1 mg的單一成分對照品儲備液。

2.2.2混合對照品溶液的制備：精密量取羥基紅花黃色素A對照品儲備液1 ml、阿魏酸對照品儲備液0.5 ml和芍藥苷對照品儲備液1 ml，置10 ml量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3供試品溶液的制備：取桃紅丸細粉約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇液30 ml，稱定重量，超聲處理8 min，放至室溫，加50%甲醇液補足減失的重量，搖勻，放置，上清液用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.3方法學考察

2.3.1專屬性試驗：取空白溶劑(50%甲醇)和對照品溶液分別進樣，記錄色譜圖，見圖1。由圖可知，空白溶劑不干擾測定。

圖1 空白溶劑、對照品溶液和供試品溶液的指紋圖譜

2.3.2線性與范圍：取各對照品儲備液逐級稀釋成系列濃度的對照品溶液進行分析，記錄3種對照品的色譜峰面積，以各指標成分的濃度(X，μg/ml)為橫坐標，以色譜峰面積A為縱坐標(Y)，繪制標準曲線。見表1。結果表明3個指標成分在所測定的濃度范圍內線性關系較好。

表1 桃紅丸三種成分的線性與范圍(n=5)

2.3.3精密度試驗：取混合對照品溶液，連續進樣6次，記錄3個組分的峰面積。羥基紅花黃色素A、芍藥苷和阿魏酸峰面積的RSD值分別為1.5%、0.6%、1.9%。結果表明儀器的精密度良好。

2.3.4重復性試驗：平行制備6份供試品溶液，進行分析，記錄指紋圖譜。記錄供試品中各指標成分相應的峰面積，計算其含量，并將6次測定結果的RSD用于考察方法的重復性。供試品溶液中羥基紅花黃色素A、芍藥苷和阿魏酸3個指標成分含量的RSD值分別為2.0%、2.6%和2.7%。結果表明該方法的重復性較好。

2.3.5回收率試驗：精密稱定桃紅丸細粉約0.5 g，共6份，分別置具塞錐形瓶中，每個錐形瓶中分別加入羥基紅花黃色素A對照品儲備液2.5 ml、芍藥苷對照品儲備液1.5 ml和阿魏酸對照品儲備液2.5 ml，再精密加入50%甲醇至30 ml，稱定重量，按“2.2.3供試品溶液的制備”項下方法配制輻照后的供試品溶液，進行分析，記錄指紋圖譜。根據回收率=(測得量-樣本含量)/加入量×100%計算3個指標成分的回收率。見表2。

表2 加樣回收率的實驗結果(n=6)

2.3.6穩定性試驗：取輻照后桃紅丸的供試品溶液，分別于0、3、6、9、24 h進樣，記錄色譜圖。計算三個指標成分相應峰面積的RSD值以考察該溶液的穩定性。羥基紅花黃色素A、芍藥苷和阿魏酸的峰面積的RSD值分別為1.5%、1.7%和2.1%。結果表明供試品溶液在24 h內的穩定性良好。

2.4供試品含量測定 取輻照前與輻照后的供試品溶液和混合對照品溶液進行分析，并記錄色譜圖。采用外標一點法計算供試品中3個組分的含量。測得供試品中羥基紅花黃色素A、芍藥苷和阿魏酸輻照前的含量分別為0.5582 mg/g、3.1050 mg/g、0.4589 mg/g；供試品中羥基紅花黃色素A、芍藥苷和阿魏酸輻照后的含量分別為0.5526 mg/g、3.1180mg/g、0.4625mg/g，輻照后含量無明顯變化。

2.5相似度分析

2.5.1供試品對照指紋圖譜的建立：取輻照前桃紅丸細粉，制備供試品溶液，進行分析，記錄指紋圖譜。

2.5.2指紋圖譜分析：取輻照后桃紅丸細粉制備8份供試品溶液，分別進樣，測定供試品的指紋圖譜。

2.5.3相似度分析：采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》研究版(2004A)對輻照前后的指紋圖譜進行分析，以輻照前樣品的色譜圖為參照圖譜，采用多點校正，用中位數法生成對照指紋圖譜和指紋圖譜。見圖2。處理數據，計算相似度，相似度均≥0.999。相似度計算結果可以看出輻照前后桃紅丸的含量變化并無顯著差異。

圖2 桃紅丸對照指紋圖譜和供試品指紋圖譜

3 討論

本研究結果顯示，所建立的指紋圖譜方法驗證結果良好，能夠滿足桃紅丸輻照前后主要成分含量變化。輻照前后，桃紅丸中羥基紅花黃色素A、芍藥苷和阿魏酸的含量均沒有顯著變化；輻照前后指紋圖譜的相似度很高，沒有峰個數的增加或缺失。實驗過程對檢測波長進行了考察，采用DAD全波長掃描檢測器，在190～400 nm波長范圍內掃描，分別在230、254、320、403 nm處對整個圖譜進行比較，發現230 nm處下各成分具有較好的紫外吸收，出峰數目相對較多，各色譜峰峰形及分離效果相對較好，且基線較為平穩，故選擇230 nm為測定波長。

該實驗分別對體積分數為50%甲醇、甲醇、50%乙醇及乙醇為提取溶劑進行了考察，經過對比峰形、響應值、峰分離情況，甲醇的提取效果更好一點。隨后又對體積分數為75%甲醇、50%甲醇、25%甲醇和水作了進一步考察，經過比較，最后選擇體積分數為50%甲醇為提取溶劑。

該實驗過程還對流動相進行了優選，首先選擇甲醇-水進行考察，提取溶劑為體積分數為50%甲醇，進行指紋圖譜的分析，但峰分離不好，基線上漂。隨后又考察了甲醇-磷酸溶液(pH 2.6)、甲醇-磷酸溶液(pH 4)、甲醇-0.5%乙酸、甲醇-1%乙酸、甲醇-KH2PO4溶液(磷酸調至pH 4)、甲醇-KH2PO4溶液(30 mmol/L，pH3)、乙腈-水、乙腈-磷酸溶液(pH 2.6)等流動相體系，以色譜峰基線的平穩情況、指標成分的峰形以及分離效果為目標，最佳的流動相為乙腈-磷酸溶液(pH 2.6)。

綜上所述，通過高效液相色譜法結合多指標定量測定法測定桃紅丸較為可靠，該方法比較全面地反映了桃紅丸的含量變化，可為其質量控制提供較為可靠的科學依據。