復合益生菌固態發酵豆粕對斷奶仔豬生長性能、腸道形態及腸道菌群的影響

熊云霞 張亞輝 李 平 吳綺雯 邱月琴 易宏波 肖 昊 蔣宗勇 王 麗

(廣東省農業科學院動物科學研究所，農業農村部華南動物營養與飼料重點實驗室，畜禽育種國家重點實驗室，嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室茂名分中心，廣東省畜禽育種與營養研究重點實驗室，廣州 510640)

豆粕是仔豬飼糧中植物蛋白質的主要來源，但是豆粕中的蛋白質成分主要是大分子蛋白質，且含有許多抗營養因子，如大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白、胰蛋白酶抑制因子以及寡糖等[1]。斷奶仔豬對豆粕中大分子蛋白質的消化能力差，且對其中的抗營養因子敏感，易造成仔豬腹瀉，阻礙仔豬生長，因此需要對豆粕進行加工處理。研究發現，通過益生菌發酵處理，不僅可以降低豆粕中抗營養因子的水平，還能改善飼糧的適口性，提高其他營養成分的含量及飼糧養分的消化率[2-5]。且益生菌發酵飼料作為新型無抗飼料，具有綠色、安全、無殘留等特性。但是單一菌種發酵飼料無法兼顧飼料的營養價值和適口性[6]，因此，工業生產制備一般采用復合益生菌協同發酵，乳桿菌、芽孢桿菌和酵母菌為生產中的常用菌種。但菌種類別及比例、菌種添加量、發酵方法及設備、發酵飼糧的添加量、飼喂時間長短、飼喂階段等方面在行業內還沒有形成成熟一致的模式。因此，本研究選用課題組自制復合益生菌固態發酵豆粕等量替換無抗飼糧中的普通豆粕飼喂斷奶仔豬，進一步探討該發酵豆粕對斷奶仔豬生長性能、腸道形態、吸收功能及腸道菌群的影響，為益生菌發酵飼糧在仔豬生產中的應用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

豬源羅伊氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)為廣東省農業科學院動物科學研究所豬營養與飼料研究室自行分離鑒定保存，植物乳桿菌CGMCC1258(LactobacillusplantarumCGMCC1258)為上海交通大學生命科學技術學院杭曉敏教授饋贈，釀酒酵母菌CNM I-1079(SaccharomycescerevisiaeCNM I-1079)購于安琪酵母有限公司，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)購于廣州市微生物研究所，各菌種經過平板涂布培養目檢及鏡檢正常后方可使用。羅伊氏乳桿菌、植物乳桿菌、釀酒酵母菌和枯草芽孢桿菌以1∶1∶1∶1的比例混合，總接種量為發酵體系質量的10%，各菌種在發酵體系的終濃度為6.05×108CFU/mL，蒸餾水添加量為40%，控制發酵溫度在37～40 ℃，發酵時間為4 d，前48 h內每隔2 h向發酵桶內通入無菌空氣10 s，后48 h將發酵桶密封進行厭氧發酵。發酵后，經檢測發現豆粕中的三氯乙酸(TCA)可溶性蛋白含量變為原來的3.19倍，豆粕大分子蛋白質被降解了56.30%，蛋白質主要分布在26 ku以下。益生菌大量存活，平板涂布計數發現每克干物質發酵豆粕含芽孢桿菌6×105CFU、乳桿菌2×109CFU(包括植物乳桿菌和羅伊氏乳桿菌)、酵母菌5×106CFU。測定豆粕發酵后主要營養成分含量變化結果見表1。發酵及檢測試驗于2017年5月2日至2017年8月20日在廣東省農業科學院動物科學研究所微生物中試車間進行。

表1 豆粕及發酵豆粕的營養成分含量(干物質基礎)

1.2 試驗設計及飼養管理

選取初始體重為(7.49±0.04)kg的21日齡“杜×長×大”三元雜交斷奶仔豬72頭，隨機分為2組，每組6個重復，每個重復6頭仔豬(公母各占1/2)。對照組(CON組)飼喂玉米-豆粕型無抗飼糧(含9%豆粕)，發酵豆粕組(FSBM組)飼喂使用發酵豆粕等量替代對照組飼糧中豆粕的試驗飼糧。試驗期14 d。

仔豬運至試驗基地后，立即進行稱重分組，打耳標，飲水添加抗應激電解液，緩解斷奶與運輸應激，每欄配有2個乳頭式飲水器和1個料槽，圈舍為高床漏縫地板，豬舍溫度控制在25 ℃左右。試驗飼糧為粉料，參照NRC(2012)營養需要配制，飼糧組成及營養水平見表2，飼糧中未添加任何抗生素。所有試驗豬自由采食和飲水。按豬場要求進行常規的免疫與驅蟲保健。飼養試驗于2017年9月6日至2017年9月20日在廣東省農業科學院動物科學研究所試驗場進行。

表2 飼糧組成及營養水平(風干基礎)

1.3 樣品采集

試驗結束時，每個重復選取1頭最接近該組平均體重的仔豬進行屠宰，頸動脈放血處死后迅速打開腹腔，無菌結扎胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸，置于冰盒內備用。取近端十二指腸、中段空腸、遠端回腸腸段約1.5 cm組織樣品，直接置于4%多聚甲醛，室溫固定過夜，用于制作腸道組織蘇木精-伊紅染色切片。取近端十二指腸、中段空腸、遠端回腸腸段剪開，用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗內容物后，玻片輕輕刮取腸內壁黏膜樣品分裝于1.5 mL離心管中，液氮速凍，-80 ℃冷凍，用于基因表達熒光定量分析。取盲腸內容物于無菌凍存管，用于16S rRNA測序。

1.4 測定指標及方法

1.4.1 生長性能測定

在試驗開始和結束時以個體為單位對所有試驗豬進行空腹稱重，試驗過程中準確記錄每個欄的采食量，記錄豬只的腹瀉情況，以計算平均日增重、平均日采食量、料重比和腹瀉率。

平均日采食量=試驗期采食量/(試驗天數×仔豬頭數)；平均日增重=試驗期增重/試驗天數；料重比=平均日采食量/平均日增重；腹瀉率(%)=[總腹瀉頭數/(仔豬頭數×試驗天數)]×100。

1.4.2 腸道組織形態觀察

取近端十二指腸、中段空腸、遠端回腸腸段約1.5 cm組織樣品，直接置于4%多聚甲醛中室溫固定過夜。從固定液中取出樣品，經修塊和組織脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、蘇木精-伊紅染色、脫水、中性樹膠封片等步驟后成片，Nikon Eclipse E100-DS-U3顯微鏡成像系統(Nikon，日本)觀察采集圖像，使用Pannoramic Viewer軟件(版本1.15.3.35149)進行腸道絨毛高度、隱窩深度的測量，每張片隨機選取5個視野觀察測量。

1.4.3 腸道黏膜組織中吸收相關基因表達測定

樣品在液氮下充分研磨為粉末，用總RNA提取試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，美國)提取組織樣本總RNA，溶解于焦碳酸二乙酯(DEPC)水中，-80 ℃存儲。用NanoDrop ND-1000分光光度計(Thermo Fisher Scientific，美國)評估RNA的濃度和純度，所有樣品A260/A280的值為1.8～2.0，并利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。取等量(1 μg)總RNA，利用反轉錄試劑盒(TaKaRa，日本)反轉錄總RNA樣品得第1鏈cDNA，反轉錄產物在-20 ℃保存備用。實時熒光定量PCR(qRT-PCR)反應(Bio-Rad CFX System)為10 μL體系：iTaq Universal SYBR Green Supermix(Bio-Rad美國)5.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，cDNA模板2.0 μL(10倍稀釋)，ddH2O 2.0 μL，每個樣品3個重復孔。擴增程序設定：95.0 ℃預變性30 s，95.0 ℃變性15 s，退火30 s，72.0 ℃延伸30 s，40個循環；之后進行熔解曲線分析。使用的引物均根據GenBank中豬的基因序列，取保守區域設計引物，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表3。以β-肌動蛋白(β-actin)作為內參基因，用2-ΔΔCt法計算目的基因的mRNA相對表達量。

表3 qRT-PCR引物序列

1.4.4 盲腸菌群16S rRNA測序

本試驗應用16S rRNA測序技術分析發酵豆粕對仔豬盲腸菌群結構的影響。采用溴化十六烷基三甲銨/十二烷基硫酸鈉(CTAB/SDS)方法提取樣本基因組DNA，Nanodrop ND-1000分光光度計(Thermo Fisher Scientific，美國)測定樣品核酸濃度并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA純度，無菌水稀釋樣品至1 ng/μL。以稀釋樣品作為模板，使用帶條形碼(Barcode)的特異引物擴增細菌16S rRNA的V3+V4區。上游引物及其序列：341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)；下游引物及其序列：806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。PCR的反應體系(Bio-Rad T 100)為30 μL：Phusion Master Mix(2×)15 μL，引物(2 μmol/L)3 μL，模板10 μL，H2O 2 μL。反應程序：98 ℃預變性1 min；30個循環(98 ℃ 10 s；50 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s)；72 ℃ 5 min。PCR產物使用2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。GeneJET膠回收試劑盒(Thermo Scientific)回收純化擴增產物。Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫試劑盒(Thermo Scientific)進行文庫的構建，構建好的文庫經過Qubit定量和文庫檢測合格后，使用Thermofisher的IonS5TMXL平臺進行上機測序。本試驗測序由北京諾禾致源科技有限公司完成。

1.4.5 生物信息學分析

根據獨特的Barcode對樣品進行分配后，通過剪切Barcode和引物序列得到Raw reads。使用Cutadapt(Martin 2011)軟件對Raw reads進行質量控制(V1.9.1，http://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/)。利用基于Silva數據庫(https://www.arb-silva.de/)的UCHIME算法(http://www.drive5.com/usearch/manual/uchime_algo.html)檢測和刪除嵌合體序列。使用Uparse軟件(Uparse v7.0.1001，http://drive5.com/uparse/)將相似度≥97%的序列聚成相同的操作分類單元(OTUs)。基于Silva數據庫，使用Mothur算法進行標注。利用序列最少的樣本對應的序列號標準對OTUs豐度信息進行歸一化處理。后續的α多樣性和β多樣性分析均基于此歸一化數據。

使用QIIME(版本1.7.0)和R包(版本2.15.3)進行生物信息學和統計分析。α多樣性指數評價物種多樣性和均勻性，并采用t檢驗評估組間各指數差異。使用β多樣性分析來評估各樣品組內和組間的差異顯著性。采用基于OTUs物理距離的主成分分析(PCA)、基于非加權Unifrac距離的主坐標分析(PCoA)顯示樣本的分布情況。線性判別分析效應(LEfSe)分析采用Mann-Whitney檢驗各組生物標志物物種(LDA score≥2)。

1.5 數據統計分析

數據使用SPSS 18.0統計分析軟件進行處理，采用獨立樣本t檢驗，統計結果用平均值及均值標準誤來表示，P<0.05為差異顯著，0.05≤P≤0.10表示有顯著趨勢。

2 結 果

2.1 復合益生菌固態發酵豆粕對斷奶仔豬生長性能的影響

如表4所示，與對照組相比，飼糧中添加復合益生菌固態發酵豆粕顯著提高斷奶仔豬終末體重和平均日增重(P<0.05)，顯著降低料重比(P<0.05)。

表4 復合益生菌固態發酵豆粕對斷奶仔豬生長性能的影響

2.2 復合益生菌固態發酵豆粕對斷奶仔豬腸道形態的影響

如圖1所示，對照組腸道絨毛有斷裂、倒伏，而發酵豆粕組腸道絨毛排列更整齊緊密。分析其絨毛高度和隱窩深度，與對照組相比，發現飼糧中添加復合益生菌固態發酵豆粕顯著提高斷奶仔豬空腸絨毛高度(P<0.05)，且空腸絨隱比有升高趨勢(P=0.07)，顯著升高十二指腸絨隱比(P<0.05)(表5)。

圖1 斷奶仔豬腸道形態

2.3 復合益生菌固態發酵豆粕對斷奶仔豬腸道吸收相關基因mRNA相對表達量的影響

如圖2所示，與對照組相比，飼糧中添加復合益生菌固態發酵豆粕顯著提高斷奶仔豬十二指腸SGLT1 mRNA相對表達量、空腸SGLT1和b0,+T以及回腸PepT1和AQP1 mRNA相對表達量(P<0.05)。

SGLT1：鈉依賴性葡萄糖協同轉運蛋白1 sodium-dependent glucose co-transporter 1；PepT1:小肽轉運載體1 small peptide transporter 1;AQP1:水通道蛋白1 aquaporins 1; b0,+AT:堿性氨基酸轉運載體 cationic amino acid transporter。

2.4 復合益生菌固態發酵豆粕對斷奶仔豬盲腸菌群的影響

本試驗共收集12個盲腸內容物樣品，經16s rRNA測序得菌群平均有效序列數為56 320條，聚類生成1 165個OTUs。共檢測到20個門、23個綱、35個目、56個科、114個屬和100個種。結果表明，飼糧中添加復合益生菌固態發酵豆粕有提高斷奶仔豬盲腸菌群α多樣性的趨勢(Shanon指數，P=0.10；Simpson指數，P=0.09；見表6)。基于OTUs物理距離的PCA分析和基于非加權unifrac距離的PCoA分析發現(圖3)，飼糧中添加復合益生菌固態發酵豆粕沒有顯著影響斷奶仔豬盲腸菌群β多樣性。分析菌群組成發現，在門水平上，菌群主要由擬桿菌門(Bacteroidetes)和厚壁菌門(Firmicutes)組成(圖4-A)，共占比80%以上，與對照組相比，添加復合益生菌固態發酵豆粕提高了Firmicutes的相對豐度(36.9% vs 44.2%)。在屬水平上，對照組優勢菌屬均為未鑒定普雷沃氏菌科(unidentified_Prevotellaceae)、厭氧弧菌屬(Anaerovibrio)和彎曲桿菌屬(Campylobacter)，占比分別為11.7%、10.0%、9.8%；復合益生菌固態發酵豆粕組優勢菌屬為unidentified_Prevotellaceae、擬普雷沃菌屬(Alloprevotella)和Anaerovibrio，占比分別為8.0%、7.2%、6.2%。其中，Alloprevotella在對照組的占比為6.8%，而Campylobacter在發酵豆粕組中的占比為2.7%。LEfSe分析發現，飼糧中添加復合益生菌固態發酵豆粕導致梭菌目(Clostridiales)、梭菌綱(Clostridia)、毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)、鼠桿菌科(Muribaculaceae)、翠桿菌屬(Turicibacter)和黏膜乳桿菌(Lactobacillusmucosae)等的富集(圖4-C)。

圖3 復合益生菌固態發酵豆粕對斷奶仔豬盲腸菌群β多樣性的影響

圖4 復合益生菌固態發酵豆粕對斷奶仔豬盲腸菌群物種的影響

表6 復合益生菌固態發酵豆粕對斷奶仔豬盲腸菌群α多樣性指數的影響

3 討 論

本課題組利用腸道益生菌做了大量的研究工作[7-8]，發現飼糧直接添加植物乳桿菌、羅伊氏乳桿菌和釀酒酵母菌均能顯著提高仔豬生長性能，改善腸道健康，提高動物免疫力，降低斷奶仔豬腹瀉[8-13]。且植物乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、釀酒酵母菌和枯草芽孢桿菌發現具有較好的分泌蛋白酶和纖維酶活性，能夠降解豆粕中的抗營養成分，提高飼糧的利用率[14-15]。因此本試驗利用以上益生菌種，對豆粕進行改良兩步法固態發酵，測定豆粕固態發酵前后主要營養成分含量變化，并進一步探究該發酵豆粕對斷奶仔豬生長性能、腸道形態、吸收功能及腸道菌群的影響。

3.1 復合益生菌固態發酵豆粕對斷奶仔豬生長性能的影響

已有大量研究報道發現，飼糧添加發酵豆粕可以提高斷奶仔豬生長性能，降低料重比和腹瀉率，降低病死率[3-4,16-18]。這是因為：1)在微生物發酵過程中產生的有機酸具有誘食作用，可提高動物采食量；2)微生物發酵可以降低豆粕中抗營養因子水平，并提高其他營養成分含量，提高動物對飼糧中營養物質的消化率[2]。在生產實踐中，由于菌種組合比例、添加量及發酵方法的不同造成發酵豆粕營養成分差別很大[19]，且在飼糧中發酵豆粕添加量、飼喂時間長短、飼喂豬生長階段也不盡相同。因此，飼喂發酵豆粕對豬生長性能的影響研究結果也不完全一致。目前應用于發酵豆粕的菌種多為芽孢桿菌、酵母菌和乳桿菌，發酵豆粕在飼糧中添加量在4.0%～24.5%，有效劑量在10%左右，飼喂時間一般在21 d以上，可顯著提高斷奶仔豬平均日增重，降低料重比[20-23]。本試驗添加9%復合益生菌固態發酵豆粕飼喂斷奶仔豬，并未發現采食量的顯著提高，但是終末體重和平均日增重顯著提高，料重比顯著降低。因此，我們推斷本試驗中，斷奶仔豬平均日增重的提高與采食量無關，可能與添加發酵豆粕的營養成分組成及營養物質消化吸收率有關。而本試驗中豆粕發酵后大豆蛋白大量降解，被降解后主要集中為26 ku左右的小肽，易于消化吸收。

3.2 復合益生菌固態發酵豆粕對斷奶仔豬腸道形態的影響

豆粕中的抗營養物質會導致腸道絨毛萎縮及隱窩增生，如胰蛋白酶抑制劑會干擾胰蛋白酶和糜乳蛋白酶的正常功能，導致腸道形態異常，并影響動物的蛋白質消化。豆粕經過復合益生菌發酵處理后，抗營養因子大大減少，可以減輕抗原蛋白對腸道黏膜的刺激和損傷，改善腸道形態結構。Feng等[23]添加24.5%發酵豆粕發現，發酵豆粕可顯著升高小腸各腸段絨毛高度，提高十二指腸隱窩深度。岳曉敬等[20]也發現，添加12%發酵豆粕可顯著改善斷奶仔豬腸道形態，改善斷奶應激造成的絨毛斷裂、粘連，提高腸道微絨毛密度和高度，且腸道絨毛整齊度好。與前人研究結果一致，本試驗添加9%發酵豆粕飼喂斷奶仔豬，發現腸道絨毛排列更整齊緊密。我們推斷飼喂發酵豆粕對腸道形態的改善可能與其對自噬相關信號通路的抑制有關，在Zhu等[24]的研究中也發現，添加復合益生菌發酵豆粕可使仔豬腸道中自噬因子微管相關蛋白1輕鏈3B(LC3B)蛋白表達降低，發酵豆粕改善腸道形態的機制仍需進一步研究。豆粕發酵后，成分變化復雜，抑制自噬相關信號通路的有效成分尚待明確。

3.3 復合益生菌固態發酵豆粕對斷奶仔豬腸道吸收相關基因表達的影響

本試驗中豆粕發酵后，粗蛋白質含量由51.93%提高55.86%，蛋白質分子質量集中在26 ku以下。研究發現，豆粕發酵后必需和非必需氨基酸含量均顯著提高[2]，且添加益生菌發酵豆粕可提高仔豬腸道蛋白酶活性[23]。飼糧中的營養物質經胃腸道消化后通過轉運載體進入腸道黏膜細胞參與機體代謝，而氨基酸、小肽、葡萄糖及水分的吸收都離不開轉運載體的作用，目前關于發酵豆粕對斷奶仔豬腸道黏膜消化吸收相關轉運載體基因的表達少有人關注。本課題組前期研究發現，飼糧直接添加羅伊氏乳桿菌可顯著改善斷奶仔豬生長性能，這與腸道黏膜氨基酸轉運載體PepT1、興奮性氨基酸轉運載體3(EAAT3)、中性和基礎氨基酸轉運載體(rBAT)、鈉離子依賴中性氨基酸轉運體(B0AT1)、b0,+AT等基因表達量的提高有關，分析其機制發現羅伊氏乳桿菌可通過提高核糖體S6蛋白(S6)及70ku核糖體S6激酶1(70S6K1)的磷酸化激活蛋白合成通路哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1(mTORC1)[12-13,25]。本研究發現，飼糧中添加復合益生菌固態發酵豆粕可顯著提高斷奶仔豬空腸b0,+T和回腸PepT1 mRNA相對表達量，發酵豆粕有可能激活機體蛋白質合成通路，其潛在機制仍需進一步研究。飼喂發酵豆粕提高腸道黏膜組織中營養物質轉運載體的表達是斷奶仔豬生長性能提高的原因之一。

3.4 復合益生菌固態發酵豆粕對斷奶仔豬腸道菌群的影響

有報道發現，飼糧添加發酵豆粕可降低斷奶仔豬腸道有害菌(大腸桿菌和沙門氏菌)的數量[21,26-27]，并增加腸道菌群的多樣性，改善菌群結構，增加腸道中厚壁菌門、乳酸菌科和乳酸菌屬等有益菌的相對豐度[28-29]。本研究也發現，飼喂復合益生菌固態發酵豆粕有提高腸道菌群物種多樣性和豐富度的趨勢，且益生菌Lactobacillusmucosae得到富集。這可能和發酵豆粕中存活的大量發酵菌種有關。有意思的是，本試驗中添加的發酵豆粕中含有大量的存活益生菌，但是只有乳桿菌在仔豬腸道中得到了富集，這可能與發酵豆粕中乳桿菌的相對豐度有關。Zhu等[24]采用16S rRNA測序技術研究飼喂發酵豆粕的斷奶仔豬的糞便和結腸內容物菌群結構，并與平均日采食量和免疫因子水平做相關分析，發現嚴格厭氧芽孢桿菌(Clostridiumsensustricto)、毛螺菌屬(Lachnospira)和擬桿菌屬(Bacteroides)相對豐度與仔豬腹瀉率呈正相關，乳桿菌屬(Lactobacillus)、布勞特氏菌屬(Blautia)和Clostridiumsensustricto相對豐度與平均日采食量呈正相關，Lactobacillus及Lachnospira相對豐度則與血清免疫球蛋白M(IgM)含量呈正相關。因此，我們推斷發酵豆粕提高斷奶仔豬生長性能和免疫力可能和腸道菌群的改善有關。Jin等[30]利用唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和釀酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)復合發酵豆粕后，應用16S rRNA測序技術結合液質聯用技術分析發酵飼糧中的菌群結構和代謝產物分布，發現發酵后，飼糧中的優勢菌種為腸球菌，而并非添加的益生菌種。且發酵后飼糧中的乳酸含量升高，總揮發性脂肪酸含量降低。進一步代謝組學分析發現，發酵使得馬來酸、苯乙酸、亞油酸乙酯、二同-亞麻酸和L-茶氨酸等得到富集，而這些代謝產物具有較好的抗菌活性。綜上所述，飼糧添加發酵豆粕影響斷奶仔豬腸道菌群的可能原因有：1)豆粕發酵后本身含有大量活的益生菌，可產生占位效應，抑制有害菌生長；2)豆粕發酵過程中產生大量生物活性物質(寡糖、多肽及促生長因子等)，促進有益菌生長，改善腸道微生物區系；3)豆粕發酵后的代謝產物具有較好的抑菌活性，阻礙有害菌的生長。發酵豆粕如何通過菌群影響機體生長代謝的機制仍有待進一步研究。

4 結 論

綜合以上研究結果，利用自制復合益生菌固態發酵豆粕等量(9%)替換無抗飼糧中普通豆粕，可提高斷奶仔豬的生長性能，改善腸道形態和吸收功能，并有提高腸道菌群多樣性的趨勢。