飼糧氮硫比對藏羔羊瘤胃發育及微生物菌群結構和功能的影響

閆小蘭 李鵬翔 侯生珍 魏 濤 賈建磊*

(1.青海大學農牧學院，西寧 810016；2.青海省畜牧獸醫科學院，西寧 810016；3.山東省煙臺市蓬萊市畜牧獸醫站，煙臺 265600)

青海省有著全國45%的藏羊資源，藏羊肉作為優質的肉品具有蛋白質含量高、脂肪含量低、礦物質豐富、口感鮮嫩、膻味少等優點。隨著我國居民生活水平的提高，對藏羊肉需求量增加，因此，探索提高藏羊生產性能的方法尤為重要。蛋氨酸是牛、羊等動物的限制性氨基酸，在瘤胃微生物的作用下的凈降解高達60%[1]。硫作為蛋氨酸的合成元素，同時也是自然界中較豐富的礦物質元素之一，與動物體內碳水物的化合合成、脂肪代謝及蛋白質代謝等活動密切相關[2]。動物缺硫則出現食欲減退、毛品質下降、體質虛弱、甚至死亡；但硫過量也會降低動物的采食量、飼糧轉化率和生產性能，并干擾其他礦物元素的吸收利用[3-5]。不同動物在不同的生長時期補充一定的硫能夠提高動物的生產性能[6-7]。當硫不過量飼喂時，有機硫和無機硫的消化相似，有機硫還原成硫化物的可能性較小，更容易直接被瘤胃微生物利用轉化為微生物蛋白質[8]。研究表明，反芻動物硫需要量通常以氮硫比的形式表示。適宜的氮硫比可提高瘤胃纖維物質的消化以及纖維消化酶的活性，促進瘤胃微生物蛋白質的合成，促進氮的沉積，從而促進反芻動物的生長[9-10]。我國目前藏羊飼養仍以粗秸稈類主，其中含硫氨基酸缺乏、非蛋白氮比例大，因此，研究藏羊飼糧中適宜的氮硫比對促進氮代謝以及提高飼糧利用率和藏羊生產水平具有重要意義。

NRC(1988)推薦反芻動物氮硫比為10∶1；但根據目前研究發現該值無法滿足不同動物在不同時期的需求[11]。前蘇聯標準[12]推薦毛肉兼用型綿羊飼糧適宜氮硫比為5∶1～6∶1，肉毛兼用型綿羊為6∶1～7∶1，生長期綿羊為8∶1～9∶1。研究發現，安哥拉山羊產毛期的飼糧適宜氮硫比為7.2∶1.0[13]；內蒙古白絨山羊在絨生長旺盛期的飼糧適宜氮硫比為7.11∶1.00，在生長緩慢期的飼糧適宜氮硫比為7.80∶1.00[14]。馮媛[10]通過體外模擬發現，飼糧氮硫比為7∶1～8∶1的綿羊的營養物質利用率最佳。

瘤胃是反芻動物特有的消化器官，其內定居著大量的微生物，能將固體飼料消化分解生成揮發性脂肪酸(VFA)、甲烷和微生物蛋白質，進而被胃腸道所吸收。適宜氮硫比能改善瘤胃的發酵環境，進而影響瘤胃上皮的發育和瘤胃微生物的活性。各國的飼養標準對反芻動物飼糧的適宜氮硫比的規定存在差異。已有的研究結果也不盡一致，而且多集中在產毛動物上，并且多以無機硫為添加源，尚未進行有機硫為添加源方面的研究。因此，本研究以青海省當地的特色物種——藏羊為研究對象，以生物學效率為100%的蛋氨酸為硫添加源，探究不同氮硫比對藏羔羊瘤胃組織形態、瘤胃液VFA含量以及微生物菌群結構和功能的影響，以期為藏羊的高效養殖提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 試驗設計與試驗飼糧

本試驗采用單因素隨機試驗設計，選擇健康狀況良好、體重相近的60日齡斷奶藏羔羊150只，隨機分5組，每組30只。由于尿素不適用于在幼齡反芻動物飼糧中應用，因此本試驗以蛋氨酸和賴氨酸替代精料補充料中的麩皮，以此調節各組飼糧的氮硫比分別為10.5∶1.0(A組)、9.0∶1.0(B組)、7.5∶1.0(C組)、6.0∶1.0(D組)、4.5∶1.0(E組)。據青海省當地飼料原料營養成分[10]配制能量和蛋白質水平相似的5組飼糧，試驗飼糧組成及營養水平見表1。

表1 試驗飼糧組成及營養水平(干物質基礎)

1.2 飼養管理與樣品采集

各組分別以氮硫比不同的飼糧進行限量飼喂。試驗動物采用全舍飼的飼養方式，按組分欄飼養，分別在每天08:00、16:00進行飼喂，自由飲水。60日齡開始補飼(干物質采食量為羔羊體重的3%，羔羊隨機采食)，預試期5 d，正試期120 d。羔羊飼養至180日齡后，每組隨機選擇6只羔羊早上空腹、頸動脈放血屠宰后，解剖，采集瘤胃腹囊部位瘤胃組織用生理鹽水清洗后，放入4%的多聚甲醛中固定。另外采集瘤胃液50 mL，于4層滅菌紗布過濾后將濾液裝于5 mL凍存管中，放入液氮中帶回實驗室于-80 ℃冷凍保存，用于后期瘤胃微生物多樣性的測定。

1.3 指標測定

1.3.1 飼糧中營養成分的測定

采用Foss半自動凱氏定氮儀(Kjeltec 2100)測定粗蛋白質(CP)含量，具體方法參考GB/T 6435—2006；粗脂肪(EE)含量使用SER148脂肪測定儀(索氏提取儀)進行測定，具體方法參照GB/T 6433—2006；酸性洗滌纖維(ADF)、中性洗滌纖維(NDF)含量使用ANKOM A200i型半自動纖維分析儀測定，具體方法參考袁翠林等[16]；粗灰分(Ash)含量采用茂福爐高溫灼燒法測定；鈣(Ca)、磷(P)、硫(S)含量的測定分別參考GB/T 6436—2002、GB/T 6437—2002、GB/T 17776—1999的方法測定。

1.3.2 瘤胃組織形態的測定

瘤胃組織在固定液中固定3 d，然后在不同濃度的葡萄糖下進行梯度脫水，包埋劑冷凍包埋，切5～7 μm連續切片，進行蘇木精-伊紅(HE)染色，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察瘤胃組織形態。使用Image-Pro Plus 5.1圖像分析系統測量瘤胃乳頭長度、乳頭寬度、乳頭角化層厚度、黏膜層厚度、黏膜下層厚度及肌層厚度。每個樣本進行3張非連續性切片的觀察，每張切片選取3個視野，每個視野中測定5組試驗數據。

瘤胃乳頭密度的測定：使用解剖顯微鏡對1 cm2的新鮮瘤胃組織樣品進行直接計數，每只羊選取3個組織樣品計數，取平均值。

1.3.3 瘤胃液VFA含量測定

利用氣相色譜儀(Thermo Scientific，美國)測定瘤胃液VFA含量。具體參考Liang等[17]方法。

1.3.4 微生物多樣性的測定

將采集的瘤胃液送到北京百邁客科技有限公司利用Illumina Hiseq 2500高通量測序平臺進行測序。主要操作流程：提取瘤胃液樣品中的總DNA，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量合格后，根據保守區設計得到引物，在引物末端加上測序接頭，進行PCR擴增并對其產物進行純化、定量和均一形成測序文庫，建好的文庫先進行文庫質檢，質檢合格的文庫用Illumina Hiseq 2500進行測序。

1.4 生物信息分析

將測序后得到的原始測序序列經過PE reads拼接、Tags過濾、去除嵌合體等最終得到的有效序列，使用QIIME軟件對Tags在97%的相似度水平下進行聚類劃分操作分類單元(OTU)。將OTU的代表序列與微生物參考數據庫進行比對可得到每個OTU對應的物種分類信息，進而在各水平統計各樣品群落組成，利用QIIME軟件生成不同分類水平上的物種分類表，再利用R語言工具繪制成樣品各分類水平下的群落結構圖。使用Mothur軟件對樣品α多樣性指數進行評估；采用Binary-Jaccard距離算法在OTU水平上比較各樣品間微生物類群的組成差異；使用PICRUSt軟件通過比對16SRNA測序數據獲得的物種組成信息，推測樣本中的功能基因組成，從而分析不同分組之間在功能上的差異。

1.5 數據分析

通過Excel 2013對數據進行初步整理，應用SAS 9.0軟件進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，試驗數據以平均值和均值標準誤(SEM)表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 飼糧氮硫比對藏羔羊瘤胃組織形態的影響

由表2可知，B組瘤胃乳頭長度、黏膜下層厚度以及肌層厚度顯著高于其他4組(P<0.05)，C、D、E組瘤胃乳頭長度顯著高于A組(P<0.05)；B、C、D組瘤胃乳頭寬度顯著高于A、E組(P<0.05)；B、E組瘤胃乳頭密度顯著高于其他3組(P<0.05)；C組瘤胃角化層厚度顯著高于其他4組(P<0.05)，其他4組間差異不顯著(P>0.05)。

表2 飼糧氮硫比對藏羔羊瘤胃組織形態的影響

2.2 飼糧氮硫比對藏羔羊瘤胃液VFA含量的影響

由表3可知，B組瘤胃液總揮發性脂肪酸(TVFA)、乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸含量顯著高于其他4組(P<0.05)。

表3 飼糧不同氮硫比對藏羔羊瘤胃液VFA含量的影響

2.3 飼糧氮硫比對藏羔羊瘤胃微生物多樣性的影響

對30只藏羔羊瘤胃液樣品進行高通量測序，將得到的原始序列雙端Read拼接、過濾后共產生3 433 220條優質序列，基于相似度大于97%的原則，每個樣品至少產生87 770條優質序列，將測序獲得的有效序列進行聚類，共獲得1 022個OTU，其中B組OTU數量顯著高于其他組(P<0.05)。由圖1可知，5組間共有632個OTU，A、B、C、D和E組的獨有OTU數量分別為13、23、22、8、8個。

圖1 藏羔羊瘤胃微生物Venn圖

應用Binary-Jaccard算法在OTU水平上對所有樣品進行主成分分析(PCoA)，由圖1可知，PC1軸的可信度為34.20%，PC2軸的可信度為10.06%，飼喂同一飼糧的藏羔羊瘤胃樣點相對聚集，飼喂不同飼糧的藏羔羊瘤胃樣點相對分散。

圖2 主成分分析圖

α多樣性指數可以反映瘤胃微生物的豐富度和均勻度。在同一測序深度下，比較5組的α多樣性指數，由表4可知，B、C組Shannon指數顯著高于A組(P<0.05)，其余各組間差異不顯著(P>0.05)；A組Simpson指數顯著高于其他4組(P<0.05)；B組Chao1指數和ACE指數顯著高于其他4組(P<0.05)；基因文庫覆蓋率均大于99%，各組之間差異不顯著(P>0.05)。

表4 α多樣性指數

2.4 飼糧氮硫比對藏羔羊瘤胃菌群結構的影響

各樣本進行I11uminaHiSeq測序平臺雙末端測序，所得有效序列在不同分類水平上進行物種注釋和統計共得到19個門、94個科、228個屬。由圖3和表5可知，在門水平下相對豐度大于0.1%的前10個菌門中厚壁菌門(Firmicutes)為5組的優勢菌門，A組厚壁菌門相對豐度顯著高于C組(P<0.05)。

表5 飼糧氮硫比飼糧對藏羔羊瘤胃細菌門水平相對豐度的影響

Others：其他；Cyanobacteria：藍藻菌門；Chloroflexi：綠彎菌門；Proteobacteria：變形菌門；Actinobacteria：放線菌門；Synergistetes：互養菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Firmicutes厚壁菌門。

由圖4和表6可知，在科水平下，5組中的優勢菌科均為毛螺菌科(Lachnospiraceae)、克里斯滕森氏菌科(Christensenellaceae)、韋榮氏球菌科(Veillonellaceae)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)；D組毛螺菌科相對豐度顯著高于A、B、E組(P<0.05)；A組韋榮氏球菌科相對豐度顯著高于C、D組(P<0.05)，其他各組間無顯著差異(P>0.05)；各組克里斯滕森氏菌科(Christensenellaceae)和瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)相對豐度差異不顯著(P>0.05)。

表6 飼糧氮硫比飼糧對藏羔羊瘤胃細菌科水平相對豐度的影響

Unclassified：未分類；Others：其他；Prevotellaceae：普雷沃氏菌科；Rikenellaceae：理研菌科；Synergistaceae：互養菌科；Ruminococcaceae：瘤胃球菌科；Veillonellaceae：韋榮氏球菌科；Christensenellacea：克里斯滕森菌科；Lachnospiraceae：毛螺菌科。

2.5 功能預測分析

利用PICRUSt軟件對已測得的基因數據進行預測，將得到的功能基因中的信息參考KEGG數據庫2級功能層基因類別劃分歸類，5組藏羔羊瘤胃細菌在二級功能層共包含39種基因功能家族，其中碳水化合物代謝、氨基酸代謝、能量代謝、輔酶和維生素代謝以及核苷酸代謝的功能基因相對豐度在5組中較高。

3 討 論

反芻動物瘤胃組織形態結構的變化可以反映其消化功能，瘤胃上皮組織與瘤胃內容物直接接觸，其組織形態可依據不同的發酵水平及外部環境變化發生相應形態學變化以滿足機體正常生理代謝需要。瘤胃乳頭增加了瘤胃上皮與內容物的接觸面積，有利于瘤胃上皮對養分的吸收和離子轉運[18]。瘤胃乳頭長度、寬度和瘤胃壁的厚度是評價瘤胃發育的重要指標[19]。刺激瘤胃乳頭發育的主要原因是有機酸的存在，尤其是VFA，其刺激強度順序為丁酸>丙酸>乙酸，這一順序與VFA被瘤胃壁組織的代謝程度相一致[20]。反芻動物對飼料中碳水化合物的消化吸收是以在瘤胃內生成VFA為主，VFA是反芻動物主要的能量來源，主要由乙酸、丙酸和丁酸組成，能促進反芻動物腸胃運動，抑制腸胃中病原微生物的生長[21]。飼糧中的纖維在纖維分解菌的作用下生成乙酸，淀粉分解菌能夠促進丙酸的沉積，厚壁菌門是瘤胃內重要的纖維消化菌[22]。張桂國等[23]研究發現，飼糧氮硫比7.2∶1.0可提高丙酸在TVFA中的比例，降低乙酸/丙酸。殷云浩等[24]研究發現，飼糧氮硫比為7.5∶1.0和9.0∶1.0可顯著降低氨態氮及乙酸、丙酸的比例。本試驗結果顯示，飼糧氮硫比為9.0∶1.0組的瘤胃內的乙酸、丙酸、丁酸以及TVFA含量顯著高于其他各組，且乙酸/丙酸最低。乙酸/丙酸常作為評價瘤胃發酵類型的標志，一般認為乙酸/丙酸小于3屬于丙酸發酵類型，而大于3為乙酸發酵類型[25]。本試驗瘤胃的乙酸/丙酸均在3以上，說明不同氮硫比沒有改變瘤胃發酵類型。飼糧氮硫比為9.0∶1.0時瘤胃乳頭長度、寬度、密度及肌層厚度較高，這與瘤胃液VFA含量的變化相吻合。由于研究對象與前人不同，因此藏羊飼糧適宜氮硫比與前人研究結果不一致。

反芻動物瘤胃內聚集著大量依靠發酵來消化飼料的微生物，瘤胃微生物的組成與結構是影響瘤胃發酵功能的重要因素。諸多要素影響瘤胃微生物區系的結構，飼糧中的各元素也是其中的重要一項。硫作為動物體內常量礦物質元素之一，是瘤胃微生物細胞結構成分或作為酶、輔酶的成分，能夠影響瘤胃微生物的活性。礦物元素缺乏會降低瘤胃微生物的生長效率，降低飼料消化率，使微生物群體數量減少，最終也會降低動物對飼料的采食量[26]。分析瘤胃液樣品的OTU數量和α多樣性，其結果可以反映微生物群落的豐度和多樣性。本研究通過HiSeq測序發現氮硫比為9.0∶1.0組的瘤胃OTU數量及ACE、Chao1、Shannon指數高于其他各組，表明該氮硫比下藏羊瘤胃微生物種類較豐富。另外，本試驗中各組覆蓋率均高于99%，覆蓋率高于97%說明測序樣品取樣充分[27]，因此，本次測序結果能真實地反映藏羔羊瘤胃細菌群落種類和結構。

Amino acid metabolism：氨基酸代謝；Biosynthesis of other secondary metabolites；其他次生代謝產物的生物合成；Cancers: Overview：癌癥：概述；Cancers: Specifictypes：癌癥：特定類型；Carbohydrate metabolism：碳水化合物代謝；Cardiovascular diseases：心血管疾病；Cell growth and death：細胞生長與死亡；Cell motility：細胞運動；Cellular community：細胞群落；Circulatory system：循環系統；Development：發育成長；Digestive system：消化系統；Drug resistance：耐藥性；Endocrine and metabolic diseases：內分泌代謝疾病；Endocrine system：內分泌系統；Energy metabolism：能量代謝；Environmental adaptation：環境適應；Excretory system：排泄系統；Folding, sorting and degradation：折疊、分類和降解；Global and overview maps：全球和概覽地圖；Glycan biosynthesis and metabolism：聚糖生物合成與代謝；Immune diseases：免疫性疾病；Immune system：免疫系統；Infectious diseases: Bacterial：傳染病：細菌性；Infectious diseases: Parasitic：傳染病：寄生蟲病；Infectious diseases: Viral：傳染病：病毒性；Lipid metabolism：脂質代謝；Membrane transport：膜傳輸；Metabolism of cofactors and vitamins：輔酶和維生素代謝；Metabolism of other amino acids：其他氨基酸代謝；Metabolism of terpenoids and polyketides：萜類化合物和聚酮類化合物的代謝；Nervous system：神經系統；Neurodegenerative diseases：神經變性疾病；Nucleotide metabolism：核苷酸代謝；Replication and repair：復制和修復；Sensory system：感覺系統；Signal transduction：信號轉導；Signaling molecules and interaction：信號分子與相互作用；Substance dependence物質依賴性：Transcription轉錄；Translation：翻譯；Transport and catabolism：運輸和分解代謝；Xenobiotics biodegradation and metabolism：外源生物降解與代謝。

微生物主要可分為細菌、原蟲和真菌三大類[28]。其中細菌是瘤胃中多樣化最高的群體，能夠利用纖維、淀粉、蛋白質和糖，在動物健康和生產性能中具有重要作用。研究發現，厚壁菌門和擬桿菌門是反芻動物瘤胃內的優勢菌門[29-20]。本研究通過高通量測序技術對飼喂不同氮硫比飼糧的藏羔羊瘤胃液進行菌群結構分析，發現各組的優勢菌門均為厚壁菌門，其他菌門的相對豐度較少。曾燕等[31]報道，綿羊瘤胃內相對豐度最高的為厚壁菌門(44.37%)，蒙古羊瘤胃內相對豐度最高的為擬桿菌門(67.00%)。韓旭峰[32]研究發現，80～110日齡陜北絨山羊瘤胃微生物以厚壁菌門為主。以上結果表明，瘤胃細菌菌體結構受反芻動物品種、日齡等因素的影響，其群落結構發生變化[33]。厚壁菌門中包含的瘤胃球菌屬、假丁酸弧菌屬、丁酸弧菌屬、顫螺旋菌屬以及真桿菌屬等菌屬主要參與纖維物質的分解[34]。本研究中，各組厚壁菌門的相對豐度均高達84%以上，氮硫比為10.5∶1.0時厚壁菌門的豐度最高(93.96%)，顯著高于氮硫比為6.0∶1.0時，而在非纖維物質的降解中發揮重要作用的擬桿菌門相對豐度最低(0.38%)，不利于營養物質的消化。研究表明，有機硫制劑能選擇性的刺激瘤胃纖維分解菌和真菌[35]。因此，氮硫比為10.5∶1.0時比較適于厚壁菌門的繁殖，不利于擬桿菌門的生長。本試驗進一步在科水平上的研究發現，厚壁菌門下的毛螺菌科、克里斯滕森氏菌科、韋榮氏球菌科、瘤胃球菌科為各組的優勢菌科。毛螺菌在消化纖維過程中與產琥珀酸絲狀桿菌具有協同作用，并且對病原菌具有拮抗作用[36-37]。韋榮氏球菌科與氨基酸、輔酶、能量和維生素的代謝，糖苷鍵代謝以次級代謝產物呈正相關[38]。本試驗中，氮硫比為6.0∶1.0時毛螺菌科相對豐度顯著高于氮硫比為10.5∶1.0、9.0∶1.0、4.5∶1.0時，氮硫水平為10.5∶1.0時韋榮氏球菌科相對豐度顯著高于氮硫比為7.5∶1.0和6.0∶1.0時。研究發現，細菌種類對底物的偏好不同，由于毛螺菌科不易體外分離培養，對毛螺菌的生理特性理解不夠深入[39]。因此，這一變化機制有待進一步研究。

瘤胃微生物菌群發酵飼料為反芻動物提供蛋白質和能量，是一個龐大的生物資源庫，因此積極挖掘一些與營養生理功能密切相關的瘤胃菌群功能基因是非常重要的，如碳水化合物轉運及代謝、氨基酸運輸和代謝、VFA的生成等[40]。Abhauer等[41]研究結果證實蛋白質和碳水化合物的代謝是微生物生存必需的一項基本功能。本試驗通過利用PICRUSt軟件對藏羔羊瘤胃細菌測序數據進行KEGG數據庫對比分析后發現，碳水化合物代謝、氨基酸代謝、能量代謝、輔酶和維生素代謝以及核苷酸代謝的功能基因相對豐度在5組中較高。由此可知，藏羔羊瘤胃細菌在提高宿主纖維與蛋白質的利用率至關重要。

4 結 論

① 飼糧氮硫比為9.0∶1.0時瘤胃組織形態發育較好，瘤胃液中VFA含量較高，瘤胃微生物的相對豐度及多樣性較高。

② 通過KEGG數據庫對比分析發現，羔羊瘤胃細菌基因功能主要集中在碳水化合物代謝和氨基酸代謝。

③ 飼糧氮硫比為9.0∶1.0更能經濟有效地促進瘤胃發育和改善羔羊瘤胃微生物區系結構。