谷物膳食纖維對高膽固醇飲食小鼠脂質代謝及腸道菌群的影響

付南燕 吳正平 周林華 韓曉群 楊 婧 周智興

(宜春學院醫學院，宜春 336000)

肥胖是由能量攝入和能量消耗之間的不平衡引起的，并且是脂質代謝破壞的危險因素[1]。與脂質代謝紊亂有關的代謝綜合征增加了患心血管疾病和2型糖尿病的風險[2-3]。脂質代謝紊亂包括膽固醇和甘油三酯(TG)含量異常，膽固醇代謝失常通常表現為總膽固醇(TC)含量增高和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)含量降低等。此外，膽固醇調節元件結合蛋白-2(SREBP-2)、3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(HMGR)、X受體α(LXRα)和膽固醇7α-羥化酶(Cyp7a1)等均為膽固醇蓄積中的關鍵酶。代謝綜合征是一個日益嚴重的社會問題，盡管其病因學涉及遺傳和環境因素之間的復雜相互作用，但飲食被認為是重要原因[4]。因此，開發對脂質代謝破壞具有預防作用的食品材料引起了廣泛的關注。目前，谷物膳食纖維(DF)已被證實影響糖尿病、血脂異常、非酒精性脂肪肝疾病和心血管疾病等[5]。研究證實，每1 kg飼糧中添加5 g DF可以緩解肝臟脂質蓄積造成的脂質代謝紊亂[6]。已提出DF對肥胖的影響機制可能與其抑制腸道內攝取膽固醇和膽汁重吸收有關[5]。此外，DF可以增加糞便中膽汁酸的排泄，并增強膽固醇到膽汁酸的轉化，可能會被結腸菌群發酵，產生短鏈脂肪酸(SCFA)，提示SCFA可抑制肝膽固醇的合成[7]。大多數膳食纖維在小腸中不被消化，而是被大腸中的微生物群代謝[8]。目前尚未見DF對小鼠生長性能、血清和糞便生化指標、膽固醇蓄積相關蛋白表達以及腸道菌群影響的報道。因此，本研究旨在評估飲食中DF對小鼠脂質代謝指標和膽固醇蓄積的作用，從而為其在動物飼養中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

嚙齒動物標準配方飼糧(Research diets D10001)；45%高脂飼糧(D12451，美國Researchdiets公司)；小麥膳食纖維(山西奧特福食品科技有限公司)；TC、TG、HDL-C含量及天冬氨酸轉氨酶(AST)和丙氨酸轉氨酶(ALT)活性測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；總膽汁酸(TBA)含量測定試劑盒(廈門慧嘉生物科技有限公司)。

1.2 動物飼養與DF處理

6周齡的雄性SPF級C57BL/6J小鼠30只(體重18～20 g)購自上海斯萊克公司[許可證號：SCXK(滬)2012-002]，小鼠單獨飼養在相對濕度(55±5)%、溫度22 ℃和12 h明暗循環的環境中。所有小鼠適應環境1周，并根據體重隨機分為4組，分別飼喂實驗室嚙齒動物標準配方飼糧(基礎飼糧，對照，CO組，n=8)、基礎飼糧+5 g/kg DF(CO+DF組，n=8)、高脂高膽固醇飼糧(45%高脂飼糧+1%膽固醇)(HF組，n=7)及高質高膽固醇飼糧+5 g/kg DF(HF+DF組，n=7)。試驗期8周。飼養8周后收集新鮮糞便，禁食不禁水12 h后，采用含有肝素鈉的真空取血管，眼球取血，冰浴靜止2 h后4 ℃、3 000 r/min離心15 min取上清液，于-80 ℃保存待用。取血完畢后，頸椎脫臼處死小鼠，摘取肝臟，萃取肝臟中的脂肪進行測定[9]。

1.3 血清和肝臟樣品的生化分析

分別根據試劑盒制造商的說明，使用酶標儀M680型(美國Bio-Rad)測定血清TG、TG和TC含量以及AST和ALT活性。

1.4 糞便中TC含量的測定

取經冷凍干燥的糞便1.00 g，加入5倍的磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH=7.4)，制成勻漿液，靜止1 h，混勻后離心取上清液，按試劑盒要求測定糞便TC含量。

1.5 蛋白質印跡

將肝臟組織樣品在蛋白酶抑制劑混合物中勻漿，使用BCA蛋白質測定試劑盒(Thermo Fisher Scientific)測定蛋白質濃度。將等量的蛋白質(20 μg)加載到4%～12%的鈉十二烷基的硫酸鹽(SDS)聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠上，然后轉移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)。用SREBP-2(ab30682，1∶1 000)、HMGR(ab174830，1∶1 000)、LXRα(ab176323，1∶2 000)、Cyp7a1(ab65596，1∶1 000)、β-肌動蛋白(β-actin)(ab8226，1∶5 000)(均購自Abcam)以及與微管相關的蛋白1輕鏈3-Ⅰ/-Ⅱ(LC3-Ⅰ/-Ⅱ，12741，1∶1 000)(購自Cell Signaling Technology公司)抗體在4 ℃下孵育過夜，在25 ℃下與抗兔免疫球蛋白G-辣根過氧化物酶標記(IgG-HRP)二抗(ab6721，1∶2 000)或抗小鼠IgG-HRP二抗(ab6789，1∶5 000)孵育1 h。使用Pierce ECL Western blotting底物(Thermo Fisher Scientific)觀察信號，使用β-actin為內參化。

1.6 SCFA定量

根據先前的研究[10]，使用氣相色譜(GC)法分析了糞便中的SCFA含量。GC儀器由GC系統(7890B；安捷倫科技公司)、毛細管柱DB-WAXetr(內徑：30 m×0.25 mm，厚度：0.25 μm，安捷倫技術公司)和保護柱DB-WAXetr(內徑：5 m×0.25 mm，厚度：0.25 μm，安捷倫科技公司)組成。

1.7 腸道菌群分析

收集糞便樣品并根據說明書使用FastPIN SPIN試劑盒(MP Biomedicals)從冷凍樣品中提取糞便DNA[11]。采用細菌16S rDNA V3～V4區通用引物(341F：5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′；806R：5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)通過PCR擴增。根據制造商的說明，使用Illumina Miseq測序系統(Illumina)進行測序。使用Metagenome@KIN軟件對確定的16S rDNA序列進行同源性搜索，用于鑒定在門和屬水平的微生物[12]。此外，從分類和確定的數量中計算出門和屬水平微生物的相對豐度。

1.8 統計分析

使用SPSS 24.0統計軟件對DF與各自的對照組之間的數據進行獨立t檢驗，使用單因素方差分析和Tukey HSD事后檢驗進行各試驗組間的分析，數據均為平均值±標準差。P<0.05為差異顯著。

2 結 果

2.1 DF對小鼠生長參數的影響

由圖1可知，CO組和CO+DF組體重在0～4周無顯著差異(P>0.05)，而CO+DF組的最終體重顯著低于CO組(P<0.05)，HF+DF組的第4周和最終體重均顯著低于HF組(P<0.05)；與CO組相比，HF組第4周和最終體重均顯著升高(P<0.05)。

與CO組相比，*表示P<0.05，與HF組相比，#表示P<0.05。下同圖。Compared with CO group, *mean P<0.05, and compared with HF group, # mean P<0.05。The same as below.

由表1可知，CO+DF組和HF+DF組攝食量與CO組和HF組相比沒有顯著差異(P>0.05)。與CO組相比，CO+DF組的攝食效率沒有顯著差異(P>0.05)，但與HF組相比，HF+DF組顯著降低(P<0.05)。CO組和CO+DF組之間的肝臟重量沒有顯著差異(P>0.05)，與HF組相比，HF+DF組中的肝臟重量和脂肪重量顯著減少(P<0.05)，與CO組相比，HF組中的肝臟重量和脂肪重量顯著增加(P<0.05)

表1 DF對小鼠生長參數的影響

2.2 DF對小鼠血清、肝臟和糞便生化指標的影響

由表2可知，CO+DF組血清TC、TG含量及AST和ALT活性以及肝臟TC和TG含量顯著低于CO組(P<0.05)，HF+DF組顯著低于HF組(P<0.05)，與CO組相比，HF組顯著升高(P<0.05)。HF組糞便TC含量顯著高于CO組，HF+DF組顯著低于HF組(P<0.05)。所有組之間的血清TBA和總蛋白含量無顯著差異(P>0.05)。

表2 DF對小鼠血清、肝臟和糞便生化指標的影響

2.3 DF對小鼠肝臟膽固醇和膽汁酸相關蛋白表達的影響

由圖2可知，DF對肝臟SREBP-2、HMGR、LXRα、LC3-I和LC3-Ⅱ的蛋白表達沒有顯著影響(P>0.05)。CO+DF組肝臟Cyp7a1的蛋白表達水平顯著低于CO組(P<0.05)，但HF組和HF+DF組之間沒有顯著差異(P>0.05)。

SREBP-2：膽固醇調節元件結合蛋白-2 sterol regulatory element binding protein-2；HMGR：3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase；LXRα：肝臟X受體α liver X receptor α；LC3-Ⅰ：微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅰ microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅰ；LC3-Ⅱ：微管相關蛋白1輕鏈3-Ⅱ microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ；Cyp7a1：膽固醇7α-羥化酶 cholesterol 7α-hydroxylase；β-actin：β-肌動蛋白。

2.4 DF對小鼠糞便中SCFA含量的影響

由表3可知，HF+DF組糞便SCFA和丙酸鹽含量顯著高于HF組(P<0.05)。糞便乙酸鹽含量在各組之間未觀察到顯著差異(P>0.05)。與相應的對照組相比，CO+DF組和HF+DF組糞便丁酸鹽含量顯著增加(P<0.05)。

表3 DF對小鼠糞便中SCFA含量的影響

2.5 DF對小鼠腸道菌群的影響

由圖3可知，在門水平上，DF減少了厚壁菌門(Firmicutes)相對豐度。CO組和CO+DF組擬桿菌門(Bacteroidetes)相對豐度沒有變化，而與HF組相比，HF+DF組中Bacteroidetes相對豐度增加。與其他組相比，僅在CO+DF組中，疣微菌門(Verrucomicrobia)相對豐度有所增加。

Deferribacteres：脫鐵桿菌門；Others:其他；Proteobacteria：變形菌門；Bacteroidetes：擬桿菌門；Actinobacteria：放線菌門；Verrucomicrobia：疣微菌門；Firmicutes：厚壁菌門；Anaerostipes：厭氧菌屬；Roseburia：羅氏菌屬；Bifidobacterium：雙歧桿菌屬；Coprococcus：糞球菌屬；Ruminococcus：瘤胃球菌屬；Anaerotruncus：厭氧棍狀菌屬；Desulfovibrio：脫硫弧菌屬；Alloprevotella：擬普雷沃菌屬；Clostridium：梭狀芽孢桿菌屬；Bacteroides：擬桿菌屬；Eubacterium：真桿菌屬；Akkermansia：阿克曼菌屬；Lactococcus：乳球菌屬；Lactobacillus：乳桿菌屬。

在屬水平上，梭狀芽孢桿菌屬Ⅳ(ClostridiumⅣ)相對豐度沒有顯著變化(P>0.05)，而梭狀芽孢桿菌屬Ⅺ(ClostridiumⅪ)相對豐度在HF組顯著升高(P<0.05)。梭狀芽孢桿菌屬ⅪⅤa(ClostridiumⅪⅤa)相對豐度在CO+DF組和HF+DF組中增加。此外，與其他組相比，僅HF+DF組中的阿克曼菌屬(Akkermansia)相對豐度顯著增加(P<0.05)。

3 討 論

膳食纖維具有多種健康特性，包括減弱血糖反應并降低膽固醇含量，可能有助于體重控制[7]。Tucker等[13]進行了一項研究調查纖維攝入量的變化是否會影響體重，結果發現多吃膳食纖維含量高的食物可以降低體重增加的風險。同樣，張薇等[6]在小鼠試驗中提示DF顯著降低脂代謝紊亂小鼠的體重、血脂、血糖及肝組織TG含量。本試驗結果與張薇等[6]的結果相似，其還報道了小鼠在正常飲食條件下飼喂DF減少了體重增加，提示DF可能通過降低正常飲食和高膽固醇飲食喂養的小鼠脂肪組織重量來降低體重。飲食中膳食纖維防止膽固醇飼喂動物的血清TC含量升高[6]，而血清ALT活性升高表明肝損傷的誘導。據報道，水溶性膳食纖維消除小鼠血清AST和ALT活性的升高[14]，這些結果與本研究結果類似。在整個試驗過程中監測了所有小鼠的健康狀況，沒有腹瀉或行為異常的跡象。此外，本研究提示飲食中的DF可以降低肝臟和血清TG的含量。

已提出DF對肥胖的影響機制可能與其抑制腸道內攝取膽固醇和膽汁酸(BA)吸收有關[5]。通過調控轉錄因子SREBP-2的活性可能可以維持肝臟膽固醇含量，從而調節HMGR蛋白表達，SREBP-2和自噬相關蛋白LC3-Ⅱ的蛋白表達也呈負相關關系[15]。此外，LXRα是核受體，調節Cyp7a1的蛋白表達，而Cyp7a1是BA合成的限速酶。先前的研究表明，攝入燕麥膳食纖維會增加小鼠的小腸組織LXR-α的蛋白表達[16]，但在本研究中DF對LXR-α的蛋白表達無顯著影響，但Cyp7a1的蛋白表達顯著降低，說明LXR-α還受其他因素的影響。

飲食對腸道菌群的組成、多樣性和豐富度有重大影響，膳食纖維是盲腸和結腸菌群的重要能源，通過提供微生物生長的底物來改變腸道的生態環境[17]。一些腸道細菌控制宿主的能量代謝，在遺傳性或飲食誘發性肥胖的動物中，Firmicutes/Bacteroides比例較高[18]。先前發現，各種膳食纖維材料在肥胖的試驗動物模型中降低了這一比例[19]。與此一致，本研究中，DF減少Firmicutes相對豐度，增加Bacteroides相對豐度。此外，Bacteroides(ClostridiumⅪ和ⅪⅤa和Bacteroidetesfragilis)負責初級膽汁的脫氫，從而導致了次級BA的產生[20]。本研究中HF+DF組的ClostridiumⅪ和ⅪⅤa相對豐度是HF組的0.4倍，表明其存在可能有助于次級BA產生的腸道菌群。腸道菌群可產生SCFA并對宿主有益，SCFA在維持健康、能量代謝和預防某些疾病中起著重要的作用。由纖維產生的SCFA可能可以預防飲食引起的肥胖癥并改善能量穩態，腸道中纖維的微生物發酵主要SCFA產物為乙酸鹽、丙酸鹽和丁酸鹽，其中，丙酸鹽對膽固醇的合成具有抑制作用[21]。膳食纖維攝入量低不僅會導致微生物多樣性降低和SCFA產生，還不利于腸道微生物的新陳代謝。盡管DF促進了糞便中的丙酸鹽的產生，但DF未能抑制膽固醇的積累和小鼠膽固醇合成中涉及的蛋白表達。因此，本研究提示丙酸鹽含量的上調可能不足以降低膽固醇的合成。據報道，ClostridiumⅪ和ⅪⅤa屬厚壁菌門，產生丁酸鹽，并有助于維持腸道免疫穩態。在本研究中，飲食中的DF增加了ClostridiumⅪ和ⅪⅤa的相對豐度，提示它們部分促進了丁酸鹽的增加。一項研究表明，攝入膳食纖維會增加動物盲腸和糞便中的丁酸鹽含量。在Akkermansia中，Akkermansiamuciniphila是唯一存在的腸道細菌，它使用黏蛋白產生乙酸鹽和丙酸鹽[22]。有報道認為，將乙酸鹽轉化為丁酸鹽的腸道細菌是糞便中SCFA含量升高的原因之一，由于丁酸鹽可抑制炎癥[23]，DF可能是因SCFA含量上調而引起次級BA減少，進而改變腸道菌群組成的食品材料。

4 結 論

每千克飼糧添加5g DF，可降低飼喂含脂45%飼糧小鼠的體重和肝臟脂肪含量，降低血清TC、TG含量及AST和ALT活性以及肝臟TC和TG含量，降低膽固醇合成相關蛋白Cyp7a1的表達水平，提高總SCFA含量、腸道有益菌群和優勢菌群相對豐度。