一步法構建萊茵衣藻葉綠體表達載體

劉國興，胡玉立，徐丹丹，徐 松

（國藥集團動物保健股份有限公司 湖北，武漢 430075）

萊茵衣藻是一種生活在淡水里的單細胞真核綠藻，其葉綠體表達的外源蛋白具有安全性好、培養周期短、遺傳穩定、容易擴大培養，并且成本低廉等優點[1,2,3]。近些年來，多種具有應用前景的蛋白在萊茵衣藻葉綠體中成功表達[4]。而一般構建衣藻葉綠體表達載體需要通過兩步克隆來完成：首先將外源基因插入克隆載體的衣藻來源的5’和3’非翻譯區（UTR）多克隆位點間，再將5’UTR-外源基因-3’UTR的表達盒酶切下，通過同源重組構建至表達載體[5,6]。為了簡化衣藻葉綠體表達載體的構建步驟，本研究構建了一種T載體pBTNK，通過一步TA克隆可將待表達的外源基因插入衣藻來源5’和3’UTR 之間，藍白斑篩選獲得陽性轉化子后，重組質粒可直接用于轉化植物，因此可簡化衣藻葉綠體中表達載體構建流程。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藻株、菌株和質粒 萊茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii137c (mt)、質粒 pCX16、pCX13、p228 由華中農業大學陳杏洲博士惠贈；大腸桿菌DH10β，質粒pShuttle、pFAST-EGFP、pT-BASIC由湖北大學蔣思婧博士惠贈。

1.1.2 酶、主要試劑和設備 BfuI 購自Thermo Scientific，LATaq酶、SolutionI 連接酶、T4DNA 聚合酶、質粒抽提試劑盒、MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、其他限制性內切酶，購自 Takara 公司，X-gal、dNTP、硫酸卡那霉素（kana）、氨芐青霉素購自北京九州同業生物科技公司，壯觀霉素購自sigma公司，PCR引物（表1）由上海捷瑞生物工程有限公司合成，Biolistic PDS-1000/He基因槍購于Bio-Rad。

1.2 方法

1.2.1 DNA 克隆 質粒提取參照OMEGA bio-tek 試劑盒說明書進行，DNA片段克隆、重組質粒鑒定等分子克隆操作參照Sambrook提供的方法進行[7]。

1.2.2 萊茵衣藻葉綠體轉化 根據文獻[8]描述的方法并適當調整后，通過基因槍法將基因導入葉綠體，即3μg載體質粒pTBNK-EGFP（1μg/μl）和2μg 抗性質粒p228（1 μg/μl）包被50μl（60 mg/mL）直徑為0.6μm金粉子彈，按壓力1100psi、真空度28英寸汞柱、目標距離6cm轟擊衣藻，將轟擊后的衣藻在TAP平板上暗培養15～20h后刮下，涂布于5皿含100μg/mL壯觀霉素抗性TAP平板，培養兩周。

1.2.3 葉綠體總DNA提取 衣藻葉綠體總DNA的抽提采用CTAB法[9]。

1.2.4 萊茵衣藻的培養 將萊茵衣藻培養在TAP 液體培養基或含1%瓊脂糖的固體平板上，在22℃～24℃、連續光照（約100 μE/m2.sec-1）條件下培養[10]。

2 結果

2.1 衣藻葉綠體表達載體pTBNK的構建

以質粒pCX16為模板，P1和P2為引物，LATaq酶PCR擴增5.7kb 同源臂上的2.0 kb 片段，回收PCR 產物后，用BamHI和SphI雙酶切并回收該2.0 kb片段，然后將酶切的片段插入pCX16 載體的BamHI 和SphI 酶切位點間，在pCX16 載體上引入NotI 酶切位點得到載體pCXN；EcoRI和SphI 雙酶切載體pCXN，回收pCXN 載體骨架5.7 kb 片段，并用T4DNA 聚合酶補平末端，將末端補平片段插入pT-BASIC 的EcoRV 酶切位點得到載體pTBN；以質粒pShuttle 為模板、P3 和 P4 為引物，LATaq酶 PCR 擴增 1.2 kb kana 抗性基因片段，將該片段回收后，BglⅡ和HindⅢ雙酶切該片段，然后將酶切后的片段插入pCX13 載體的BglⅡ和HindⅢ酶切位點間獲得載體pCX13-kana；用BamHI 將 pCX13-kana 載體上 5’UTR-BfuI-kana-BfuILacO 部分序列-3’UTR 表達盒酶切下，T4 DNA 聚合酶補平末端，然后和NotI 酶切、T4DNA 聚合酶補平末端的pTBN 載體片段用SolutionI 連接酶進行連結，獲得衣藻葉綠體定向表達T載體pTBNK（圖1）。

2.2 一步克隆構建衣藻葉綠體表達載體pTBNK-EGFP

以 pFAST-EGFP 為模板，P5 和 P6 為引物，LAtaqPCR擴增 EGFP 基因并回收該產物，BfuI 酶切 pTBNK 載體，連接后轉化至大腸桿菌DH10β 感受態細胞，涂布于含氨芐青霉素（50μg/ml）和X-gal（30μg/ml）的LB固體平板上，避光培養12～14h 后觀察，挑顯藍色的菌落（圖2）進行PCR鑒定（圖3）。經鑒定，陽性克隆達100%，表明重組衣藻表達載體pTBNK-EGFP構建成功。

2.3 表達載體pTBNK-EGFP導入衣藻葉綠體

pTBNK-EGFP 經基因槍法轉化萊茵衣藻葉綠體后，經100μg/mL壯觀霉素抗性篩選，共長出4個綠色單藻落，抽提野生型的葉綠體總DNA和第八次傳代的轉基因衣藻的葉綠體總 DNA 作為模板，以 P5 和 P6 為引物，PCR 擴增EGFP片段，結果顯示四個轉基因衣藻DNA樣本中均可以擴增出目的條帶而野生型DNA樣本無法成功擴增目的條帶（圖4），表明EGFP成功插入萊茵衣藻葉綠體。

3 討論

我們設計在載體克隆位點引入BfuI 酶切位點，該酶的特點是特異性識別5’-gtatcc-3’序列，并在該序列下游任意6 個堿基處對DNA 進行切割，切割后形成粘性末端“T”，而LAtaqDNA 聚合酶擴增的目的片段帶“A”尾。這樣，可通過TA克隆將目的片段克隆到pTBNK。

基于LacO重構原理[11]，在PCR 擴增目的片段的下游引物5’增加7bp的部分LacO序列（5’-CACAATT-3’），載體骨架上攜帶 13bp 的部分LacO序列（3’-AATTGTGAGCGCT-5’），載體片段和目的片段連接后，轉化到lac+的菌株感受態細胞，涂布于含X-gal的平板，完整的LacO序列會競爭性的吸附宿主菌表達的LacI 蛋白，使宿主菌的乳糖啟動子控制的β-半乳糖苷酶基因表達解抑制，表達β-半乳糖苷酶，分解X-gal使菌落呈現藍色。因此，只有目的基因閱讀框正確插入克隆位點組成完整LacO序列才會使菌落顯藍色，而基因閱讀框反向插入或空載體，菌落均呈白色。統計顯示，EGFP基因克隆至該載體并轉化后，藍色菌落占總菌落數的50%～60%，而且藍色菌落均為閱讀框正確插入的重組子（圖3）。

圖1 衣藻葉綠體定向表達T載體構建流程圖

圖2 藍白斑篩選重組子平板

圖3 1:DNAmmaakkeerr 2Kpluuss IIII；2～2200：藍斑菌落PPCCRR擴增EEGGFFPP基因；2211～2255：白斑菌落PPCCRR擴增

本實驗構建衣藻葉綠體表達載體pTBNK，克隆效率高、篩選方法簡便、耗時短、成本低，而且不受酶切位點的影響，具備通用性，且重組子可通過藍白班篩選，優于傳統的兩步法酶切構建表達載體[7,11]。遺憾的是，本實驗中EGFP未表達。盡管如此，該構建方法極大簡化外源基因插入萊茵衣藻葉綠體表達載體的步驟，載體構建思路也可能適用于其他葉綠體表達載體的構建。

圖4 1:DNAmmaakkeerr 2Kpluuss IIII；2～5：轉基因衣藻抽提總DDNNAA作為模板PPCCRR 擴增EEGGFFPP 基因；6：野生型衣藻抽提總DDNNAA 作為模板PPCCRR擴增EEGGFFPP基因