水孔蛋白-5在機械通氣致急性肺損傷大鼠肺組織中的表達研究*

陳美羽，趙毓靜，張新日

（山西醫科大學第一醫院 呼吸與危重癥學科，山西 太原030001）

慢性阻塞性肺疾病、哮喘、呼吸衰竭等疾病是呼吸系統常見病，臨床通過機械通氣進行呼吸支持治療，維持患者血氧飽和度。但機械通氣時間過長，通氣量過大，可出現機械通氣相關性肺損傷，對肺組織造成二次打擊，嚴重時可導致急性肺損傷（acute lung injury, ALI）或急性呼吸窘迫綜合征發生。ALI 主要病理生理特征是彌漫性肺泡水腫和肺泡液清除率下降，肺泡上皮細胞損傷和肺毛細血管內皮細胞通透性升高，肺泡腔內富集含蛋白和炎癥細胞因子的水腫液，破壞肺泡細胞表面氣液交換屏障的平衡，導致急性呼吸窘迫綜合征發生[1-2]。

水孔蛋白-5（Aquaporin-5, AQP-5）位于Ⅰ型肺泡上皮細胞，是調節水分子轉運的功能性蛋白，生理狀態下可協助清除肺泡腔內多余水分，保持肺泡腔干燥環境[3]。但AQP-5 在ALI 過程中對水腫液清除作用的機制仍不明確。多項研究顯示[4-7]，不同類型損傷因素致ALI 條件下，AQP-5 表達趨勢不穩定。本研究通過大潮氣量機械通氣快速復制大鼠ALI 模型[8]，觀察在不同的機械通氣時間下，AQP-5 在肺組織中表達的變化，探討其在機械通氣致ALI 中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康雄性SD大鼠30只，體重270～320 g，均由山西醫科大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號[SCXK（晉）2015-0001]。

1.2 主要試劑與儀器

兔抗鼠AQP-5 一抗（武漢博士德生物公司，編號：BA2205），SABC 免疫組織化學染色試劑盒[即用型SABC-POD（兔IgG），武漢博士德生物公司，編號：SA1022]，RWD407 型小動物呼吸機（深圳瑞沃德公司）。

1.3 方法

將30 只大鼠按照不同的機械通氣時間，完全隨機分為對照組、0.5 h 組、1.0 h 組、1.5 h 組和2.0 h組，每組6只。適應性飼養1 周，實驗前12 h 禁食，自由飲水。大鼠稱重并記錄，用于計算麻醉劑量和肺系數。水合氯醛（40 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠后，仰臥位置于小動物實驗臺上，頸前剪毛備皮消毒，沿頸部正中縱向切開約1.5 cm，逐層鈍性分離皮膚及皮下肌肉組織，暴露氣管。

對照組大鼠行氣管切開，保持氣道通暢，自由呼吸室內空氣（吸氧濃度21%），不給予機械通氣。2 h 后行常規胸、腹部消毒，逐層打開腹腔并暴露腹主動脈，迅速放血處死，處置方法符合動物倫理學標準。快速打開胸腔，鈍性分離組織取出肺臟，立即置于預冷的生理鹽水中漂洗2、3 次，用無菌紗布吸干肺表面水分。留取肺大體標本，用于觀察肺組織大體形態損傷程度；取右肺稱濕重，用于計算肺系數，評估肺組織水腫程度；取左肺于4%多聚甲醛溶液中固定24 h 后進行HE 染色和免疫組織化學染色，光鏡下觀察肺組織損傷程度和檢測各組肺組織中AQP-5 的表達。

0.5 h 組、1.0 h 組、1.5 h 組和2.0 h 組大鼠行氣管切開后連接小動物呼吸機，呼吸室內空氣（吸氧濃度21%），分別給予機械通氣0.5 h、1.0 h、1.5 h 和2.0 h，4組呼吸機參數設置一致：VT=30 ml/kg，I∶E為1∶1，PEEP為0 cmH2O，RR為60次/min。4 組大鼠機械通氣結束后立即處死留取標本，處置方法同對照組大鼠。

1.4 觀察指標

1.4.1 HE 和免疫組織化學各組大鼠肺組織經過多聚甲醛固定，酒精梯度脫水，二甲苯透明石蠟包埋冷卻，制成4 μm 厚切片，過夜烤片。HE 染色：二甲苯、酒精梯度進行組織脫蠟，蘇木精-伊紅染色，酒精、二甲苯梯度脫水，風干后樹膠封片，光鏡下觀察各組肺組織損傷程度。免疫組織化學：組織脫蠟，枸櫞酸鹽高壓抗原熱修復，5%BSA封閉液封閉，孵育兔抗鼠AQP-5 一抗（1∶100）37℃1 h，SABC 免疫組織化學染色試劑盒二抗孵育，DAB 顯色，蘇木精復染，封片，光鏡下觀察并評估各組肺組織中AQP-5 的表達。

1.4.2 肺系數通過肺系數顯示肺組織水腫損傷程度。分別稱量機械通氣前大鼠體重和右肺組織重量，計算肺系數：肺濕重（g）/體重（kg）×100%，肺系數越大表示肺水腫程度越嚴重。

1.4.3 AQP-5 免疫組織化學染色結果判定方法采用染色強度評分和AQP-5 陽性細胞占比評分[9]判定AQP-5 染色結果。每組取6 張切片，每張切片隨機選擇3 個視野，以肺泡上皮細胞頂膜出現棕黃色顆粒為陽性細胞。首先按照染色強度評分：棕褐色為3 分，棕黃色為2 分，淺黃色為1 分，無色為0 分；再按陽性細胞占視野內細胞的百分比評分：＞75% 為4 分，75%～＞50% 為3 分，50%～＞10%為2分，≤10%為1分，陰性為0分。評分越高表示肺組織中AQP-5表達越多。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS 22.0 統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗，相關分析用Spearman法，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠肺組織大體標本

對照組大鼠肺組織大體標本體積正常，表面光滑，色澤粉嫩，質軟（見圖1A）；與對照組比較，0.5 h組、1.0 h 組、1.5 h 組和2.0 h 組大鼠肺組織體積增大，肺葉邊緣外翻，有彌漫性出血，質韌（見圖1B～E 中箭頭所示）。表明機械通氣時間的延長對肺組織大體形態改變有影響。

圖1 各組大鼠肺組織大體標本

2.2 各組大鼠肺系數比較

各組大鼠肺系數比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；進一步兩兩比較，1.0 h 組和1.5 h組大鼠肺系數差異無統計學意義（P＞0.05）；其余各組大鼠肺系數組間兩兩比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.3 各組大鼠肺組織HE染色結果

對照組大鼠肺泡腔大小正常，形態規整，肺泡壁完整、無炎癥細胞浸潤，肺間質無水腫（見圖2A）；與對照組比較，0.5 h組、1.0 h組、1.5 h組和2.0 h組大鼠肺泡壁可見不同程度破裂、肺大泡形成，肺泡腔內有紅細胞及粉紅色水腫液滲出，肺間質水腫、炎癥細胞浸潤（見圖2B～E 中箭頭所示），為典型ALI 病理形態學特征，表明機械通氣致大鼠ALI 模型復制成功。

2.4 各組大鼠肺組織免疫組織化學染色結果

對照組大鼠肺組織染色均勻一致、呈棕褐色（見圖3A）；與對照組比較，0.5 h 組、1.0 h 組、1.5 h 組和2.0 h 組大鼠肺組織染色不均勻，呈現棕黃色、淺黃色，AQP-5 表達逐漸減少甚至無（見圖3B～E 中箭頭所示）。表明機械通氣時間對肺組織中AQP-5 表達有顯著影響。

表1 各組大鼠肺系數比較 （n=6，±s）

表1 各組大鼠肺系數比較 （n=6，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與0.5 h組比較，P ＜0.05；③與1.0 h組比較，P ＜0.05；④與1.5 h組比較，P ＜0.05。

肺系數組別1.18±0.035 2.24±0.119①3.33±0.072①②3.41±0.202①②4.03±0.200①②③④376.693 0.001對照組0.5 h組1.0 h組1.5 h組2.0 h組F 值P 值

圖2 各組大鼠肺組織病理切片HE染色圖 （×100）

圖3 各組大鼠肺組織病理切片免疫組織化學染色圖 （×100）

2.5 各組大鼠肺組織AQP-5 免疫組織化學染色強度評分與陽性細胞占比評分比較

各組大鼠肺組織AQP-5 免疫組織化學染色強度評分和AQP-5 陽性細胞占比評分比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；進一步兩兩比較，1.0 h 組和1.5 h 組AQP-5 染色強度評分和AQP-5陽性細胞占比評分比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；其余各組AQP-5 染色強度評分和AQP-5 陽性細胞占比評分兩兩比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.6 肺系數與AQP-5 免疫組織化學染色強度評分和陽性細胞占比評分的相關性

肺系數與AQP-5 免疫組織化學染色強度評分呈負相關（rs=-0.925，P=0.001）；肺系數與免疫組織化學AQP-5 染色陽性細胞占比評分之間呈負相關(rs=-0.951，P=0.001）。

表2 各組大鼠肺組織免疫組織化學AQP-5染色評分比較（n=6，±s）

表2 各組大鼠肺組織免疫組織化學AQP-5染色評分比較（n=6，±s）

注：①與對照組比較，P ＜0.05；②與0.5 h組比較，P ＜0.05；③與1.0 h組比較，P ＜0.05；④與1.5 h組比較，P ＜0.05。

組別染色強度評分陽性細胞占比評分對照組0.5 h組1.0 h組2.50±0.13①1.40±0.26①②3.60±0.18①2.40±0.16①②1.5 h組2.0 h組F 值P 值2.80±0.11 1.30±0.18①②0.40±0.22①②③④207.522 0.001 3.80±0.13 2.20±0.19①②0.70±0.27①②③④216.311 0.001

3 討論

水孔蛋白家族被發現以來，已有13 種AQPs 亞型，特異性分布于人體各器官組織中[10]。AQPs 的分子量約28 kD，是一種含有胞質N-始端和C-末端的跨膜通道蛋白，由H1～H6 6 個跨膜片段組成，兩兩間相互靠近，共形成A～E 5 個“環區”。B 區和E 區反向平行接近形成“沙漏模型”，即疏水孔。中心孔開關的活性由門控或細胞膜中AQPs 的豐度來調節，這種縮窄性空間構型決定了水孔的滲透選擇性[11]。

在肺組織中，AQP-5 表達于Ⅰ型肺泡上皮細胞頂膜近換氣側，水分子的轉移依賴跨肺泡上皮和肺微血管內皮細胞的滲透梯度完成[3,11]。MA[5]發現敲除AQP-5基因，肺泡透水性較生理狀態下可降低10倍，表明AQP-5 介導肺泡上皮細胞的水分子跨膜轉運機制。劉洋等[6]發現在不同潮氣量機械通氣中，大潮氣量組肺組織中AQP-5 表達量下調，可能與肺水腫發生機制有關?？梢姡珹QP-5 的表達與急性肺水腫互為因果，相互促進。PIRES-NETO等[7]研究結果顯示，AQP-5 的表達量在不同病因致急性呼吸衰竭患者的肺組織中均增加，認為AQP-5 對肺損傷的反應可能隨時間波動，并與肺損傷的強度和類型有關。本研究采用大潮氣量機械通氣誘導大鼠ALI，研究結果顯示，與對照組大鼠相比，隨著通氣時間延長，各機械通氣組肺組織體積逐漸增大，光鏡下可見肺泡壁破裂、肺泡腔及肺間質內水腫液滲出、炎癥細胞浸潤等細胞形態學的損傷程度逐漸加重，肺系數逐漸升高，提示肺水腫程度逐漸增加；而AQP-5 在肺組織中的表達逐漸減少。相關性分析結果顯示，肺系數與肺組織AQP-5免疫組織化學染色評分呈負相關。

FABREGAT 等[12]發現在低潮氣量機械通氣大鼠肺組織中，AQP-5表達隨著暴露時間的延長而增加，肺水腫程度逐漸減輕，認為AQP-5 對肺組織有保護作用。在本研究中值得關注的是，1.0 h 組和1.5 h 組肺系數結果比較，差異無統計學意義，可以反映出在持續機械通氣過程中，肺水腫加重程度呈現短暫的緩慢趨勢。結合免疫組織化學結果，1.0 h 組和1.5 h 組AQP-5 染色強度評分比較，差異無統計學意義，AQP-5 在1.0 h 組和1.5 h 組肺泡上皮細胞膜的表達僅占對照組肺組織細胞的50%左右，這部分肺組織中的AQP-5 可能對肺泡水腫液清除存在代償機制，減緩肺水腫的進一步發生。但這種代償機制并非持續作用，隨著通氣時間延續到2 h，肺泡上皮細胞及血管內皮完整性破壞嚴重，AQP-5 表達下降，AQP-5 對水通量的調節超過正常轉運限度，對肺水清除出現失代償。由此可見，AQP-5 參與機械通氣致肺水腫的發生、發展，對肺泡水腫液的及時清除和吸收起到關鍵作用。

綜上所述，隨著機械通氣時間延長，肺水腫程度逐漸加重，肺組織中AQP-5 表達逐漸減少，表明AQP-5參與機械通氣致肺水腫的發生、發展。