支氣管哮喘患兒CHI3L1基因多態性與糖皮質激素療效的關系研究

彭昊，龍博文，鐘煒，李德優

（萍鄉市婦幼保健院1.兒科，2. PICU，3.小兒呼吸內科，江西 萍鄉337000）

支氣管哮喘（以下簡稱哮喘）是一類進行性氣道慢性炎癥性疾病，多見于兒童和青少年群體[1]。2014年，全球哮喘防治創議將哮喘進一步納入“異質性疾病”的范疇，認為多基因遺傳因素對哮喘的發病具有十分重要的影響[2]。目前，臨床上對哮喘患兒的治療方式分為控制性治療和緩解性治療。其中糖皮質激素屬于一線長期控制性藥物，但是很多患兒對吸入性糖皮質激素治療存在明顯的個體差異性[3]，推測可能與個體的遺傳學組成不同有關。近幾年，隨著藥物遺傳學理論的逐漸成熟，很多學者已經鑒定了多種與吸入性糖皮質激素療效相關的糖皮質激素受體基因。2017年，ZHU 等學者[4]通過一項全基因組關聯研究發現CHI3L1基因多態性與哮喘發生風險密切相關。幾丁質酶樣蛋白40（chitinaselike protein,YKL-40）是CHI3L1基因編碼產物，參與氣道炎癥反應和重塑過程[5]。而且楊麗霞等學者[6]證實布地奈德可影響大鼠模型血清YKL-40 蛋白水平。因此筆者推測CHI3L1基因多態性可能通過影響炎癥反應和氣道重塑而影響哮喘的發展及糖皮質激素的療效。鑒于CHI3L1基因多態性與哮喘易感性及氣道炎癥反應之間的密切關系，本研究以江西省萍鄉市婦幼保健院就診的漢族哮喘患兒為研究對象，探討CHI3L1基因多態性與哮喘患兒接受吸入性糖皮質激素治療6 個月后療效的關系，為本地區哮喘患兒的個體化臨床治療提供藥物遺傳學標記及用藥方案指導。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

前瞻性收集2018年1月—2018年12月在萍鄉市婦幼保健院兒科就診的慢性中度持續期哮喘患兒130 例。其中，男性79 例，女性51；年齡2～12 歲，平均（6.45±2.29）歲。納入標準：①符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016年版）》[7]關于慢性中度持續期支氣管哮喘的診斷標準；②哮喘嚴重程度≥3 級；③近4 周內無糖皮質激素局部或全身用藥史；④由患兒家長或法定監護人簽署知情同意書，并遵醫囑完成治療和隨訪。排除標準：①近2 周內有呼吸道感染病史者；②合并感染性疾病、免疫系統疾病、支氣管肺炎、呼吸衰竭、肺結核及先天性心臟病患兒；③對糖皮質激素禁忌者。另取同期在本院兒保科體檢的健康兒童50例為對照組，均無哮喘或變應性疾病史。其中，男性25例，女性25例；年齡2～12 歲，平均（6.50±2.50）歲。哮喘患兒和對照組兒童的年齡、性別構成比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 治療方案

哮喘組患兒給予常規對癥治療，包括止咳、化痰、解痙平喘、糾正酸堿平衡、維持電解質等，嚴重者可給予吸氧；除此以外，霧化吸入布地奈德混懸液（英國Astra Zeneca 公司，規格：2 ml∶1 mg，批號：8339000）0.5 mg和硫酸沙丁胺醇溶液（蘇州葛蘭素史克制藥有限公司，規格：1 ml∶5 mg，批號：C629118），2次/d，10 min/次，連續治療12周。

1.3 療效觀察

治療12 周后，觀察患兒喘息、咳嗽、哮鳴、氣促、胸悶等臨床癥狀改善情況，根據《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南（2016年版）》[7]，評估患兒治療結束后4 周內日間癥狀（＜6 歲：＞1 次/周；≥6 歲：＞2 次/周）、夜間憋醒或咳嗽癥狀、應急緩解藥物使用次數（＜6歲：＞1次/周；≥6歲：＞2次/周）和活動能力。良好控制：癥狀完全緩解，偶發輕度發作且可自行緩解；部分控制：存在1、2 項上述臨床癥狀；未控制：存在3、4 項上述臨床癥狀。其中達到良好控制者視為療效良好；部分控制者和未控制者視為療效不良。

1.4 肺功能檢查

治療前和治療12 周后，采用Master Screen Paed肺功能檢測儀（德國JAEGER公司）檢測哮喘患兒肺功能，包括第1 秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in one second,FEV1）、用力肺活量（forced vital capacity,FVC）、FEV1/FVC。

1.5 CHI3L1基因多態性檢測

采集所有受試兒童肘靜脈血5 ml，置于依地酸二鈉（EDTA-Na）抗凝管中，3 000 r/min 離心20 min分離血清和血細胞，將血細胞提取全血基因組DNA 并進行單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism, SNP）分型檢測。基因多態性檢測方法：①采用全血基因組DNA 小量抽提試劑盒（上海生工生物工程有限公司）提取DNA。②采用紫外分光光度法對DNA 純度和濃度進行檢測。③反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，50℃退火30 s，延伸30 s，共循環35 次，72℃繼續延伸5 min，得到PCR 擴增產物，取8 μl PCR 擴增產物進行TaqMan-PCR 反應。反應體系配制：2 μl 10×Buffer，1 μl 特異性限制性內切酶，9 μl 去離子水，于37℃反應12～14 h。④將PCR 產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。⑤將50 μl 測序樣品送至上海生工生物工程有限公司進行純化測序；并采用BLAST 軟件進行同源序列分析。等位基因頻率=（2×純合子個體數+雜合子個體數）/（2×受試兒童）。按照Hardy-Weinberg 平衡法對群體代表樣本進行分析。設計CHI3L1基因rs10399805、rs4950928、rs883125位點基因引物，引物由上海生工生物工程有限公司合成并提供。見表1。

表1 CHI3L1基因rs10399805、rs4950928、rs883125位點基因SNP分析

1.6 統計學方法

數據分析采用SPSS 17.0 軟件統計。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗；計數資料以構成比（%）表示，比較用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg平衡檢驗

經Hardy-Weinberg 平衡法檢驗，CHI3L1基因rs10399805、rs4950928、rs883125 3 個基因位點處于遺傳平衡（χ2=0.174、1.125和0.073，P=0.843、0.554和0.942），具有群體代表性。

2.2 對照組與哮喘組兒童CHI3L1 基因SNP 位點的基因型分布頻率

對照組與哮喘組CHI3L1基因rs10399805位點基因型分布頻率比較，經χ2檢驗，差異無統計學意義（P＞0.05）。對照組與哮喘組rs4950928 位點基因型分布頻率比較，經χ2檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05）；對照組CC 基因型分布頻率高于哮喘組。對照組與哮喘組rs883125 位點基因型分布頻率比較，經χ2檢驗，差異有統計學意義（P ＜0.05）；對照組GG 基因型分布頻率低于哮喘組。見表2和圖1。

表2 對照組與哮喘組兒童CHI3L1基因SNP位點基因型分布頻率比較 例（%）

圖1 CHI3L1基因SNP位點基因多態性檢測

2.3 療效良好組與療效不良組患兒CHI3L1 基因SNP位點的基因型分布頻率

所有130例慢性中度持續期哮喘患兒遵醫囑完成了本項研究，最后經檢查，90 例（69.23%）患兒獲得良好控制，作為療效良好組；另40 例（30.77%）患兒獲得部分控制或者未控制，作為療效不良組。療效良好組與療效不良組CHI3L1基因rs10399805 位點基因型分布頻率比較，經χ2檢驗，差異無統計學意義（P＞0.05）。療效良好組與療效不良組rs4950928 位點基因型分布頻率比較，差異有統計學意義（P ＜0.05）；療效良好組CC 基因型分布頻率高于療效不良組。療效良好組與療效不良組rs883125 位點基因型分布頻率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；效良好組GG 基因型分布頻率低于療效不良組。見表3。

表3 療效良好組與療效不良組患兒CHI3L1基因SNP位點基因型分布頻率比較 例（%）

2.4 3組CHI3L1基因位點患兒治療前后肺功能指標比較

rs10399805 位點TT 型、CT 型和CC 型患兒治療前后FEV1、FVC、FEV1/FVC 的差值比較，經方差分析，差異無統計學意義（P＞0.05）。rs4950928 位點CC 型、CG 型和GG 型患兒治療前后FEV1、FVC、FEV1/FVC 的差值比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；CG 型和GG 型低于CC 型（P＜0.05），CG型低于GG型（P＜0.05）。rs883125位點CC型、CG 型和GG 型患兒治療前后FEV1、FVC、FEV1/FVC 的差值比較，經方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05），CC 型和CG型高于GG 型（P＜0.05）。見表4。

表4 3組CHI3L1基因位點患兒治療前后肺功能指標的差值比較 （±s）

表4 3組CHI3L1基因位點患兒治療前后肺功能指標的差值比較 （±s）

基因位點rs10399805 n FEV1/L FVC/L FEV1/FVC/%TT CT CC F 值P 值rs4950928 CC 73 9.12±1.87 9.04±1.23 11.87±2.01 CG GG F 值P 值rs883125 0.000 0.000 0.000 CC CG GG F 值P 值12 54 64 6.12±1.23 6.33±2.01 6.51±2.56 2.076 0.129 7.23±1.42 7.14±1.33 6.99±2.01 0.260 0.771 7.21±1.21 7.18±1.89 7.45±2.22 0.304 0.738 51 6 4.89±1.23 6.09±1.11 98.035 5.00±1.01 7.86±1.23 137.347 5.64±1.00 9.23±1.38 181.301 78 32 20 7.23±1.23 6.82±1.11 5.87±1.00 16.719 0.000 8.09±1.23 7.72±0.89 6.00±1.34 39.025 0.000 8.88±2.01 9.00±1.97 6.12±1.21 36.386 0.000

3 討論

哮喘涉及的發病機制復雜，尤其是遺傳易感性、環境暴露和炎癥反應屬于最重要的致病因素。隨著遺傳學和分子生物學研究的深入，越來越多的基因多態性被證實與哮喘密切相關[8-10]。例如，本院曾對100 例健康兒童和100 例哮喘患兒進行RORA基因多態性檢測，發現rs11071559 和rs7164773 位點基因型分布頻率和等位基因頻率存在統計學差異，推斷RORA基因多態性與哮喘的發生存在一定的關聯[11]。另外李明基和陳敏等學者[12-13]通過Mass ARRAY-IPLEX 質譜陣列技術證實CHI3L1基因多態性可能是兒童哮喘發生的易感因素，而且由CHI3L1基因編碼的YKL-40 蛋白有望成為評價哮喘患兒病情嚴重程度及監測病情變化的一個新標志物。但是國外也有研究證實CHI3L1基因與哮喘可能無關[14]。

本研究通過TaqMan-PCR 反應證實在萍鄉市哮喘患兒中CHI3L1基因rs4950928 和rs883125 位點基因型分布頻率與健康兒童不同，但是并未發現rs10399805 位點基因型分布頻率的差異性分布，這與國外USEMANN 等學者[15]的研究結論不一致，據推測可能是因為納入樣本量、納入標準不同，以及與種族、地域、環境、飲食等因素存在差異有關。隨著基因多態性的發現，也為臨床個體化治療提供了新的思路。吸入性糖皮質激素是目前臨床上哮喘患兒首選的長期控制藥物，但是不同個體對激素的反應存在較大的差異，部分患兒即使長期規范使用或加大劑量使用吸入性糖皮質激素，仍然無法獲得理想的臨床緩解[16-18]。因此，從個體遺傳因素方面尋找預測吸入性糖皮質激素反應敏感性的指標對實現個體化治療和精準醫療具有重要意義。

CHI3L1基因位于人類染色體1q31～1q32，具有遺傳高度保守性，可廣泛表達于人類各組織中。有學者發現，CHI3L1基因在黏膜炎癥細胞中表達明顯上調[19]，而且由CHI3L1基因編碼的YKL-40 蛋白在氣道、心血管、神經、關節等相關炎癥疾病中也發揮重要作用，可作為炎癥疾病預防和治療的新靶點[20-22]。而糖皮質激素的作用機制為抑制炎癥基因轉錄，阻滯前炎癥反應，進而減輕炎癥細胞聚集、浸潤、活化等[23]。因此筆者推測CHI3L1基因可能與糖皮質激素治療后的氣道反應性存在一定的關聯。本研究首次發現，吸入性糖皮質激素治療療效良好組與療效不良組患兒CHI3L1基因rs4950928 和rs883125 位點的基因型分布頻率具有明顯差異。在用藥一致、療程一致、且使用劑量為推薦劑量的前提下，療效良好組患兒rs4950928 位點CC 基因型分布頻率明顯高于療效不良組患兒，同時rs4950928 位點CG 基因型分布頻率和rs883125位點GG 基因型分布頻率明顯低于療效不良組患兒，從而證實了筆者之前的推測。肺功能檢查是目前臨床上用于評價哮喘嚴重程度的重要指標之一[24-25]，為了進一步證實CHI3L1基因多態性與吸入性糖皮質激素療效的關系，筆者從肺功能改善角度發現，治療前后CHI3L1基因rs4950928 和rs883125 位點不同基因型患兒FEV1、FVC、FEV1/FVC 的差值存在差異，例如rs4950928 位點CG 型和GG型患兒治療前后FEV1、FVC、FEV1/FVC的差值低于CC 型，且CG 型低于GG 型；同時，rs883125 位點CC 型和CG 型患兒治療前后FEV1、FVC、FEV1/FVC的差值高于GG 型。說明CHI3L1基因rs4950928 和rs883125位點基因多態性與肺功能有關，這可能也是影響糖皮質激素治療療效的原因之一。

綜上所述，遺傳因素在哮喘發生和治療方面具有重要作用。通過對本院納入的130例2～12歲慢性中度持續期哮喘患兒CHI3L1基因rs10399805、rs4950928、rs883125位點基因型進行分析，證實在萍鄉市兒童中，CHI3L1基因rs4950928 和rs883125 位點基因多態性可能與哮喘易感性和吸入性糖皮質激素反應敏感性有關，對攜帶rs4950928 位點C/G 基因型和rs883125位點G/G基因型的患兒，建議選擇其他藥物代替糖皮質激素，以提高患兒的治療效果。