PPAR γ基因多態性與新生兒肺炎易感性及血清炎癥細胞因子的關系

田靜，惠曉君，張靖，任亞方，張朋

（南陽市中心醫院1.新生兒科，2.小兒外科，河南 南陽473000）

感染性肺炎是新生兒的常見疾病之一，也是引起新生兒病死的常見病因之一，其發生與新生兒免疫系統尚未發育完善，容易感染細菌、病毒、支原體等病原菌有關，但具體的發病機制未完全闡明。 過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator activated receptor γ, PPAR γ）屬于核受體超家族，是一類由配體激活的轉錄因子，參與糖脂代謝、炎癥反應、氧化應激反應的調控[1-2]。編碼PPAR γ基因存在廣泛的單核苷酸多態 性（single nucleotide polymorphism, SNP），其 中rs1801282 是研究最多的PPAR γ基因SNP 位點[3-4]。該位點CCA 向GCA 的突變被證實是≥14 歲的肺炎膿毒癥患者發生多器官功能障礙的保護因素[5]，但這一突變是否與新生兒肺炎的發生有關尚未見明確報道。為此，本研究擬檢測肺炎新生兒PPAR γ基因rs1801282 位點的SNP，分析該基因SNP 與新生兒肺炎發生、血清炎癥細胞因子質量濃度的關系，進而為新生兒肺炎發病機制的研究及未來疾病的個體化防治提供理論支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性選取2016年3月—2019年3月南陽市中心醫院收治的感染性肺炎新生兒90 例。納入標準：①符合新生兒細菌性肺炎的診斷標準；②胎齡37～42 周；③臨床資料及臨床樣本完整；④取得家長知情同意。排除標準：①有宮內缺氧或新生兒窒息史；②有吸入性肺炎、新生兒呼吸窘迫綜合征；③合并先天性畸形或其他先天性疾?。虎芎喜⒚庖呷毕?。根據病情將感染性肺炎新生兒分為輕癥肺炎組52 例和重癥肺炎組38 例。另取同期在該院分娩的80 例健康新生兒作為對照組。本研究經醫院倫理委員會批準。3 組新生兒一般資料的比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。見表1。

表1 3組新生兒一般資料的比較

1.2 方法

1.2.1 重癥肺炎的評價方法感染性肺炎新生兒符合下列任意1 項，即判斷為重癥肺炎：①吸入氧濃度（FiO2）≥60%，監測動脈血氧飽和度（SaO2）＜92%；②出現休克；③出現呼吸窘迫或多器官衰竭；④出現反復呼吸暫停或慢而不規則的呼吸。

1.2.2 PPAR γ 基因rs1801282 位點SNP的檢測采集3 組新生兒的靜脈血2 ml，EDTA 抗凝后采用血液基因組DNA 提取試劑盒（北京天根公司）分離提取抗凝靜脈血中的基因組DNA，操作按照試劑盒說明書進行。得到基因組DNA 后，配置PCR 體系：基因組DNA 1 μl、2×Taq PCR 預混試劑Ⅱ10 μl、10 μmol/L 的正反向引物各0.4 μl、去離子水8.2 μl。按照下列程序進行反應：95℃預變性3 min，95℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環35 次。取PCR產物，配置酶切體系，37℃水浴過夜。次日，取酶切產物，在瓊脂糖凝膠中電泳，根據電泳結果判斷PPAR γ基因rs1801282 位點的SNP。

1.2.3 血清炎癥細胞因子的檢測采集3 組新生兒的靜脈血2 ml，室溫靜置30 min 后自然凝血，3 000 r/min 離心20 min，分離上層血清后采用酶聯免疫吸附試驗（試劑盒購自上海西唐公司）檢測白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、細胞間黏附分子-1（ICAM-1）的質量濃度，操作按照試劑盒說明書進行。

1.3 統計學方法

數據分析采用SPSS 21.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗；計數資料以構成比（%）表示，比較用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組新生兒PPAR γ基因rs1801282位點多態性的比較

PCR 酶切產物的瓊脂糖電泳圖如圖1所示，酶切產物為267 bp 是GG 基因型，酶切產物為267 bp、224 bp、43 bp 是GC 基因型，酶切產物為224 bp、43 bp 是CC 基因型。PPAR γ基因rs1801282 位點CC為野生基因型，GC、GG 為突變基因型。3 組新生兒CC 基因型的比例及等位基因C 的頻率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；重癥肺炎組和輕癥肺炎組新生兒CC 基因型的比例及等位基因C 的頻率高于對照組，GC+GG 基因型的比例及等位基因G 的頻率低于對照組；重癥肺炎組新生兒CC 基因型的比例及等位基因C 的頻率高于輕癥肺炎組，GC+GG 基因型的比例及等位基因G 的頻率低于輕癥肺炎組。見表2。

2.2 3組新生兒血清炎癥細胞因子的比較

圖1 PCR酶切產物的瓊脂糖電泳圖

表2 3組PPAR γ基因rs1801282位點多態性的比較例（%）

3 組新生兒的血清IL-6、TNF-α、ICAM-1 的質量濃度比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；進一步兩兩比較，重癥肺炎組和輕癥肺炎組新生兒的血清IL-6、TNF-α、ICAM-1 質量濃度高于對照組（P＜0.05），重癥肺炎組新生兒的血清IL-6、TNF-α、ICAM-1 質量濃度高于輕癥肺炎組（P＜0.05）。見表3。

表3 3組血清IL-6、TNF-α、ICAM-1質量濃度的比較（±s）

表3 3組血清IL-6、TNF-α、ICAM-1質量濃度的比較（±s）

組別n IL-6/（pg/ml）TNF-α/（ng/ml）ICAM-1/（ng/ml）對照組輕癥肺炎組重癥肺炎組F 值P 值80 52 38 9.93±1.34 20.37±5.57 41.94±8.94 470.862 0.000 41.22±7.96 60.39±11.91 131.28±26.58 462.197 0.000 137.65±28.79 201.41±48.93 376.57±71.47 327.475 0.000

2.3 肺炎組中不同PPAR γ 基因多態性新生兒血清炎癥細胞因子的比較

肺炎組中PPAR γ基因rs1801282 位點GC+GG 基因型新生兒的血清IL-6、TNF-α、ICAM-1 質量濃度低于CC 基因型新生兒，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表4。

表4 肺炎組中不同PPAR γ基因多態性新生兒血清IL-6、TNF-α、ICAM-1質量濃度的比較 （±s）

表4 肺炎組中不同PPAR γ基因多態性新生兒血清IL-6、TNF-α、ICAM-1質量濃度的比較 （±s）

組別n IL-6/（pg/ml）TNF-α/（ng/ml）ICAM-1/（ng/ml）GC+GG基因型CC基因型t 值P 值9 8 1 26.12±6.68 59.69±11.83 13.088 0.000 87.75±10.39 113.46±29.49 5.497 0.000 266.59±44.48 354.31±89.49 4.967 0.000

3 討論

PPAR γ是重要的核轉錄因子，參與糖脂代謝、炎癥反應、氧化應激反應的調控。PPAR γ基因存在廣泛的多態性，其中rs1801282 是目前研究最廣泛的PPAR-γ基因SNP 位點，該位點位于外顯子2 第12位密碼子，發生CCA 向GCA 的突變后、編碼的氨基酸從脯氨酸轉變為丙氨酸，進而造成編碼產物蛋白結構及功能的改變[6-7]。該突變在不同人群中存在差異，其中亞洲人群中PPAR γ基因rs1801282 位點SNP 的發生率低于白種人[8]。張曉伏[9]報道，漢族人群PPAR γ基因rs1801282 位點GC+GG 突變基因型的比例約15%且發生純合突變，即GG 基因型的患者僅1 例。本研究所納入的健康新生兒中，PPAR γ基因rs1801282 位點SNP 的發生率為20%，與國內已有的研究報道基本一致。

PPAR γ基因的編碼產物具有抑制炎癥反應的作用[10-11]，當rs1801282 位點發生SNP 后，PPAR γ基因編碼產物的抑炎作用可能受到影響，進而參與多種炎癥疾病的發生[12-13]。朱小蔚[5]對肺炎膿毒癥患者PPAR γ基因rs1801282 位點SNP 的分析證實，合并重度器官衰竭的肺炎膿毒癥患者無一例發生GG 純合突變，僅1 例發生GC 雜合突變，rs1801282 位點GC+GG 基因型的比例低于輕度器官衰竭的肺炎膿毒癥患者，提示PPAR γ基因rs1801282 位點C 向G 的突變可能在肺炎膿毒癥中起到保護作用。本研究肺炎新生兒PPAR γ基因rs1801282 位點CC 基因型的比例高于對照組，GC+GG 基因型的比例低于對照組，重癥肺炎組CC 基因型的比例高于輕癥肺炎組，GC+GG 基因型的比例低于輕癥肺炎組，說明PPAR γ基因rs1801282 位點SNP 與新生兒肺炎的發生有關，C向G 突變的減少會造成新生兒肺炎的發生。

PPAR γ的抑炎作用與其對多種炎癥細胞因子表達的抑制作用有關，孫小平[14]的動物實驗證實，PPAR γ的激動劑羅格列酮對膿毒癥小鼠炎癥細胞因子IL-6、TNF-α 的分泌具有抑制作用；BHAT[15]的動物實驗證實，PPAR γ對高脂血癥小鼠體內炎癥細胞因子ICAM-1 的分泌具有抑制作用。IL-6、TNF-α、ICAM-1 3 種炎癥細胞因子在炎癥反應的激活過程中起到促炎、促黏附等作用，已經被證實在新生兒肺炎的發病過程中大量分泌[16-18]。本研究對肺炎新生兒血清中炎癥細胞因子的分析結果與已有的研究一致，即肺炎新生兒血清中IL-6、TNF-α、ICAM-1 的質量濃度升高且重癥肺炎組血清中IL-6、TNF-α、ICAM-1 的質量濃度高于輕癥肺炎組。進一步分析PPAR γ多態性對血清炎癥細胞因子分泌的影響可知，肺炎組中PPAR γ基因rs1801282 位點GC+GG 基因型新生兒的血清IL-6、TNF-α、ICAM-1 質量濃度低于CC 基因型新生兒，說明PPAR γ基因rs1801282位點C 向G 的突變能夠起到抑炎作用，減少炎癥細胞因子的釋放。

綜上所述，本研究對PPAR γ基因rs1801282 位點SNP 的分析說明，PPAR γ基因多態性與新生兒肺炎的發生、發展有關，C 向G 的突變是在發病過程中起保護作用，能夠減少多種炎癥細胞因子的釋放；PPAR γ基因rs1801282 位點SNP 的檢測可能作為篩查新生兒肺炎高危人群的潛在靶點，為疾病的個體化防治提供依據。