貝萊斯芽孢桿菌抑尖孢鐮刀菌脂肽類物質的鑒定

郭 蔓，張朝正，趙 華*

（天津科技大學生物工程學院工業發酵微生物教育部重點實驗室天津市工業微生物重點實驗室天津市微生物代謝與發酵過程控制技術工程中心，天津 300457）

尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）是在全世界范圍內廣泛傳播的、能引起多種植株萎蔫枯死的一種土傳性病害病原菌[1]，對番茄（Lycopersicon esculentum）、葫蘆科（Cucurbitaceae）植物、棉花（Gossypiumspp.）和香蕉（Musa nana）等高經濟價值作物具有很大的危害[2]。尖孢鐮刀菌在防控方面非常的困難，主要是因為尖孢鐮刀菌除了能夠在宿主植物中存活外，還能在土壤及空氣中存活10年以上，仍表現出很強的致病性[3]。該病原菌最先由LINK發現并命名[4]，其形態差異較大，迄今為止已有多種尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）被分離并鑒定，根據侵染的農作物的不同，將尖孢鐮刀菌分為不同的專化型，而又根據其致病能力的差異在不同專化型下可分為不同的生理小種[5]。

植物病毒害有多種防治方法[6]，其中，生物防治是一種環保無污染的方式。生物防治是利用微生物之間，以及微生物與植物之間的相互作用實現有益微生物對有害微生物的抑制作用[7]。許多微生物通過產生拮抗物質抑制尖孢鐮刀菌的生長，是一種經濟有效的方法，不僅不會對環境造成二次污染，還能夠從源頭控制其生長[8]。對于尖孢鐮刀菌引起的枯萎病進行生物防治的微生物有真菌、細菌、放線菌[9-10]。芽孢桿菌屬（Bacillussp.）是一類重要的生防細菌，其多個種類具有較好的生物防治功能[11]。枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）廣泛存在于自然界中，因其具有拮抗范圍廣、效果明顯，繁殖快，無害無污染等優點而被廣泛應用為生防細菌[12]。研究發現芽孢桿菌對多種真菌性病原體都具有很好拮抗效果，其分泌的纖維素酶和蛋白酶等拮抗物質抑制病原菌的生長，由于抑菌物質分泌在胞外，拮抗效果更加明顯[13]。

芽孢桿菌在生長與繁殖過程中會產生許多具有抑菌活性的代謝產物[14]，如細菌素[15]、伊枯草菌素、表面活性素、二磷酸硫胺素、幾丁質酶、纖維素酶[16]、堿性蛋白酶、β-甘露聚糖酶和氨肽酶等[17]。有研究表明，從土壤中分離出來的貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）對番茄灰斑病菌具有抑制作用，抑菌圈直徑可達15.5 mm，其無菌發酵液對灰斑病菌絲的生長有強烈的抑制作用[18]；貝萊斯芽孢桿菌B18對香蕉枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌古巴專化型熱帶4號生理小種的生物防治有較好的效果，防治效果高達67.9%[19]。前期已從實驗室分離篩選獲得1株貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）P9，其代謝產物對尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）生長具有較強的抑制作用[20-21]。前期的實驗已經確定產生的抑菌物質主要為脂肽類抗生素。因此，本研究對貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）發酵液中的抑菌物質進行分離純化和鑒定，將其與已報道的抑菌活性代謝產物進行比較，以期獲得新物質，為利用生防制劑控制尖孢鐮刀菌提供理論依據，為微生物生防農藥的化學合成提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）P9：天津科技大學工業發酵微生物重點實驗室篩選獲得；尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）：天津科技大學菌種保藏中心，編號TCCC40009。

1.1.2 培養基

LB培養基[22]：酵母浸物5.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、氯化鈉10.0 g/L，pH7.2～7.4，固體培養基時另添加瓊脂18.0 g/L，121 ℃滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potatodextroseagar，PDA）培養基[23]：馬鈴薯浸出液200 g/L，葡萄糖20 g/L，pH自然。固體培養基時另添加瓊脂18 g/L，115 ℃滅菌20 min。

1.1.3 試劑

酵母浸粉（生化試劑）：天津一方科技有限公司；蛋白胨（生化試劑）：上海易勢化工有限公司；氯化鈉、甲醇（分析純）：天津艾利安電子科技有限公司；葡萄糖（分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司；濃鹽酸（分析純）：天津市北方醫化學試劑廠；乙腈（色譜級）：天津康科德科技有限公司；甲酸（色譜級）：天津益仁達化工有限公司。其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

H1815高速離心機：湘儀離心儀器有限公司；HPX-9162 MBE電熱恒溫恒濕培養箱：上海博訊實業有限公司醫療設備廠；SY.45-NJB牛津杯（Φ6 mm×8 mm×10 mm）：北京先驅威鋒技術開發公司；G6545B高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜聯用（high performance liquid chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometry，HPLC-Q-TOF-MS）儀、1200高效液相色譜儀：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 脂肽類抗菌物質的提取

酸沉淀法提取：將3 mL貝萊斯芽孢桿菌P9接種于100 mL LB培養基中，于30 ℃、170 r/min條件下培養48 h，收集50 mL發酵液至離心管中，8 000 r/min離心20 min。取上清液，用1 mol/L的鹽酸調節pH至2.0，4 ℃靜置12 h。收集溶液，8 000 r/min離心20 min，棄上清液。所得沉淀加入5 mL甲醇，用NaOH調節pH至7.0，室溫抽提8 h，抽提過程中可以放在超聲儀中加速溶解，4 ℃、12 000 r/min離心20 min，抽提過程重復3次，收集所有抽提液，利用旋轉蒸發儀進行濃縮。濃縮液用0.22 μm的濾膜進行抽濾，即得到抗菌脂肽粗提物。

有機溶劑沉淀法提取：取50 mL無水乙醇緩慢添加到50 mL發酵液中，邊加邊攪拌，然后在4 ℃條件下靜置過夜，4 ℃、12 000 r/min條件下離心20 min，分別收集上清液和沉淀。將上清液經旋轉蒸發儀濃縮至5 mL，沉淀用5 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）溶解，經0.22 μm的生物濾膜過濾除菌體，即得到抗菌脂肽粗提物。

1.3.2 體外抑菌活性的測定

尖孢鐮刀菌孢子液制備：將尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）劃線接種于PDA培養基，30 ℃條件下靜置培養5 d，使用滅菌打孔器在菌落邊緣區域取直徑為5 mm的菌餅，放置于PDA平板中央，30 ℃恒溫培養4～5 d，取無菌生理鹽水水洗，所得的水洗液經滅菌的4層無菌濾布過濾即得真菌孢子液，將所得的真菌孢子液稀釋至OD600nm值為0.9，4 ℃條件下保存備用。

抑菌活性的測定：取100μL尖孢鐮刀菌孢子液均勻涂布于PDA平板上，在距平板中心25 mm處放置牛津杯（Φ6 mm×8 mm×10 mm），每個牛津杯中加入利用不同提取方法提取的抗菌脂肽提取液100 μL，置于30 ℃恒溫培養箱培養4 d，采用牛津杯法測量抑菌圈直徑[24]。

1.3.3 脂肽類物質的高效液相色譜分析

將提取的脂肽類物質粗提物進行高效液相色譜分析，色譜條件：Eclipse XDB-C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），進樣量20 μL，流動相為乙腈∶水=40∶60（V/V），流速1 mL/min，檢測波長210 nm，分析時間14 min。通過色譜圖分析該脂肽類物質粗提物的種類。

1.3.4 脂肽類抗生素的分離制備

制備柱為EclipseXDB-C18色譜柱（5μm，9.4mm×250mm），進樣量1 mL，流動相為乙腈∶水=40∶60（V/V），流速5 mL/min，檢測波長210 nm，按峰閾值收集樣品。將收集到的各峰樣品在65 ℃條件下旋轉蒸發濃縮，進行冷凍干燥，可得到固體脂肽類物質[25]。采用牛津杯法測定體外抑菌活性，將有抑菌活性的物質進行質譜分析。

1.3.5 脂肽類物質高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜分析

將1.3.4中多功能液相分離制備出來的有抑菌活性的組分進行高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜分析。液相色譜條件為：ZOBAX C18色譜柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm），進樣量5 μL，柱溫30 ℃，檢測波長210 nm，流速0.5 mL/min，檢測時間15 min。流動相A：0.1%甲酸的水，流動相B：100%乙腈，A∶B=60∶40（V/V）。質譜條件：毛細管電壓160 V，噴霧電壓1 kV，干燥氣溫度320 ℃，正離子模式檢測，檢測范圍為150～1 000 amu。利用電噴霧離子化（electrospray ionization，ESI）-質譜測定脂肽類化合物的相對分子質量，并對一級質譜的主要離子峰進行分析。

2 結果與分析

2.1 脂肽類抗生素粗提物體外抑菌活性的測定

脂肽類抗生素粗提物對尖孢鐮刀菌的抑制作用見圖1。由圖1可知，通過酸沉淀法和有機溶劑沉淀法從貝萊斯芽孢桿菌P9發酵液中提取出來的脂肽類抗生素粗提物對于尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）都有明顯的體外抑菌活性，抑菌圈直徑分別為（13.5±0.05）mm，（8.5±0.08）mm，其中，酸沉淀法的抑菌效果優于有機溶劑沉淀法。因此，對酸沉淀法提取出來的脂肽類抗生素粗提物進行進一步研究。

圖1 脂肽類抗生素粗提物對尖孢鐮刀菌的抑制作用Fig. 1 Inhibitory effect of crude extract of lipopeptide antibiotics on Fusarium oxysporum

2.2 脂肽類抗生素粗提物的高效液相色譜分析

采用高效液相色譜分析酸沉淀法得到的脂肽類抗生素粗提物，結果見圖2。由圖2可知，該脂肽類抗生素粗提物分別在3.1 min、6.6 min、7.1 min、7.6 min、8.1 min、9.2 min、11.1 min出現7個主要的離子峰，推測該脂肽類抗生素粗提物主要有7種組分，編號為1#～7#。

圖2 脂肽類抗生素粗提物的高效液相色譜分析結果Fig. 2 Analysis results of crude extract of lipopeptide antibiotics by HPLC

2.3 脂肽類抗生素物質的分離制備

通過多功能制備液相儀對這7種組分進行分離，并利用牛津杯法測定各組分的抑菌性能，結果見表1。由表1可知，7種組分中有4種組分有明顯的抑制尖孢鐮刀菌生長的作用，分別為組分2#、4#、6#、7#，其對尖孢鐮刀菌的抑菌圈直徑分別為（13.3±0.01）mm、（13.5±0.04）mm、（14.5±0.02）mm、（13.2±0.01）mm。

表1 7種組分對尖孢鐮刀菌的抑制作用Table 1 Inhibitory effect of 7 components on Fusarium oxysporum

2.4 脂肽類抗生素物質的高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜分析

采用高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜聯用儀對4種組分（2#、4#、6#、7#）的一級質譜的主要離子峰進行分析，結果見圖3～圖6。

圖3 組分2#的高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜分析結果Fig. 3 Analysis results of component 2#by HPLC-Q-TOF-MS

圖4 組分4#的高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜分析結果Fig. 4 Analysis results of component 4#by HPLC-Q-TOF-MS

圖5 組分6#的高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜分析結果Fig. 5 Analysis results of component 6#by HPLC-Q-TOF-MS

圖6 組分7#的高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜分析結果Fig. 6 Analysis results of component 7#by HPLC-Q-TOF-MS

由圖3可知，組分2#的質譜圖中，在質核比1 036.691 9、1 058.672 9、1 074.567 9處有準碎片離子峰，與研究報道中[26]的芽孢桿菌產生的脂肽化合物的精確質荷比值[M+H]+、[M+Na]+和[M+K]+的數據吻合，可以得出組分2#中可能含有C15SurfactinA或C16SurfactinB或C15Surfactin C。這三種物質的[M+H]+、[M+Na]+和[M+K]+完全相同，為同分異構體。SurfactinA、SurfactinB、SurfactinC的結構式如下：

由圖4可知，組分4#的質譜圖中，在質核比1 045.557 8、1 067.539 1、1 083.507 3處有準碎片離子峰，與魯小城[26]研究中C15BacillomycinD的[M+H]+、[M+Na]+和[M+K]+質荷比相符合，所以確定組分4#為C15BacillomycinD。BacillomycinD的結構式如下：

由圖5可知，組分6#的質譜圖中，在質核比1 031.542 1、1 053.522 9、1 069.492 5處有準碎片離子峰，與文獻[26]中C14BacillomycinD的[M+H]+、[M+Na]+和[M+K]+質荷比相符合，從而確定組分6#為C14BacillomycinD。

由圖6可知，組分7#的質譜圖中，在質核比1 059.572 9、10 81.553 4、1 097.545 1處有準碎片離子峰，與文獻[26]中C16BacillomycinD的[M+H]+、[M+Na]+和[M+K]+質荷比相符合，確定組分7#為C16BacillomycinD。

3 結論

本研究選用貝萊斯芽孢桿菌P9為研究對象，通過酸沉淀法和有機溶劑沉淀法從其發酵液中提取脂肽類抗生素粗提物。通過牛津杯抑菌實驗發現，該脂肽類抗生素粗提物對尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）有較好的抑菌活性，且酸沉淀法提取的粗提物抑菌活性較高。通過多功能制備液相儀從粗提物中共分離出7種成分，其中4種成分有抑菌活性。通過高效液相色譜-四級桿飛行時間質譜聯用儀分析對這4種成分進行鑒定，確定菌株P9發酵液中具有抗菌活性的脂肽類物質為C14-16BacillomycinD的同系物及C15SurfactinA或C15Surfactin C或C16SurfactinB。本研究闡明了貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）P9抑制尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）生長的主要活性成分，為利用生防制劑控制尖孢鐮刀菌生長提供理論依據。