山西老陳醋對急性醉酒小鼠防醉及護肝作用研究

田穎蕾，夏 婷，康超艷，趙宇軒，呂 潔，張祥龍，王怡明，閆裕峰，朗繁繁，鄭 宇，3，王 敏*

（1.天津科技大學省部共建食品營養與安全國家重點實驗室生物工程學院，天津 300457；2.山西紫林醋業股份有限公司，山西 太原 030400；3.食醋發酵科學與工程山西省重點實驗室，山西 太原 030400）

酒是中國飲食文化的重要組成部分，至今已有五千多年歷史。有研究表明，機體對酒精攝入沒有安全劑量[1-2]。但其他研究發現，適度飲酒能愉悅身心、促進血液循環，但飲酒過度會造成機體損傷[3-4]。酒精濫用和酒精依賴是當前面臨的嚴重問題，人體一次性攝入70～80 g的酒精會引起中毒，達到250～500 g的劑量還會導致死亡。中國的飲酒致死人數世界第一，每年因此致死的人數多達70萬[5]。急性醉酒又稱急性酒精中毒（acute alcoholism，AAH），一次性過量飲酒會使血液中乙醇含量升高，隨后引起頭暈、惡心嘔吐、昏迷等癥狀，并伴隨著神經、消化、呼吸、心腦血管等系統的損傷[6-7]。酒精主要通過肝臟分解代謝，而多次AAH會引起酒精性肝病的發生[8-9]。近年來AAH的發病率越來越高，且自2019年以來成為除心腦血管及腫瘤外的世界第三大公共衛生問題[10]。

目前，天然化合物在酒精性肝病的治療中有很大潛力，研究表明一些膳食中的天然成分，如黃酮類化合物、白藜蘆醇等具有體外抗氧化活性，可對肝臟起到保護作用[11-13]。老陳醋中含氨基酸、有機酸、多酚、黃酮、川芎嗪、類黑精等活性成分，具有調節血脂、血糖、保護肝臟以及抗腫瘤等功效[14-16]。本實驗組前期研究發現山西老陳醋可以抑制小鼠細胞色素P450 2E1（cytochrome P450 2E1，CYP2E1）和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶活性和Toll樣受體4（Tolllike receptor 4，TLR4）誘導的炎癥反應，對氧化應激誘導的肝損傷有保護作用[17-18]。目前，國內外關于食醋的醉酒預防作用機制研究相對較少，有待于進一步研究。本試驗建立急性醉酒小鼠模型，40只美國癌癥研究所（Institute of Cancer Researcch，ICR）小鼠隨機分成空白對照組、模型組及低、高劑量山西老陳醋組，并在灌胃4 h后，觀察醉酒后小鼠行為學和小鼠肝組織病理學，分別檢測血清中乙醇含量及谷草轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷丙轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）活性和肝組織生化指標（乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）、乙醛脫氫酶（acetalde hydedehydrogenase，ALDH）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和丙二醛（mal ondialdehyde，MDA）。探究山西老陳醋對急性醉酒小鼠的防醉和護肝作用。以期提升傳統食醋的保健價值和推動相關功能產品開發。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

實驗小鼠（挑選40只體質量在30～34 g的無特定病原體（specific pathogen，SPF）級雄性美國癌癥研究所（ICR）小鼠）：北京維通利華實驗動物技術有限公司。山西老陳醋（釀造食醋，生產許可證號：SC10314012101087）：山西紫林醋業股份有限公司；56%vol紅星二鍋頭（食品生產許可證編號：SC11511160310087）：北京紅星股份有限公司。

1.1.2 試劑

肝素鈉：北京索萊寶科技有限公司；血乙醇、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、總蛋白定量測定試劑盒（bicinchonininc acid，BCA）法、乙醇脫氫酶（ADH）、乙醛脫氫酶（ALDH）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

CP1502型電子分析天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；1500型全波長酶標儀：美國Thermo有限公司；UVmini-1240型微量紫外分光光度計：蘇州島津儀器有限公司；Centrifuge 5418 R冷凍離心機：德國Eppendorf有限公司；1X2-1LLJ100普通光學顯微鏡：日本Olympus有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組與處理

小鼠適應性飼養后，按體質量分層后隨機分組為空白對照組、模型組及低、高劑量醋組，每組10只。空白對照組小鼠不做處理；模型組小鼠灌胃給予56%vol紅星二鍋頭13 mL/kg；低、高劑量食醋組小鼠在分別灌胃給予山西老陳醋1.25 mg/kg和2.5 mg/kg，30 min后，一次性灌胃給予56%vol紅星二鍋頭13 mL/kg。

1.3.2 急性醉酒小鼠的行為學觀察

各組小鼠灌胃白酒后，立刻開始計時并進行翻正反射實驗判斷小鼠是否醉酒（觀察小鼠是否可以保持背部向下30 s，能則判定為醉酒，反之則沒醉），并記錄醉酒時間（末次灌胃時間-翻正反射消失時間）、醒酒時間（翻正反射消失時間-翻正反射恢復時間）。

1.3.3 肝組織病理形態學觀察

各組小鼠末次灌胃4.0 h后，迅速剖取肝臟，冰生理鹽水沖洗、擦干后稱其質量，拍照；多聚甲醛（4%）固定肝組織，經石蠟包埋后制成切片（5 μm），使用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色切片，光鏡觀察肝臟的病變情況。參考肉眼觀察法和脂肪變性評分標準來衡量肝臟組織損傷程度、肝竇充血程度和肝臟細胞空泡化程度等指標[19-20]。

1.3.4 血清和肝臟中指標檢測

各組小鼠在末次灌胃0.5 h和4.0 h后處死小鼠，眼球取血后，獲得的血液加入抗凝劑肝素鈉后在4 ℃、3 000 r/min的條件下離心15 min后取上清液，-80 ℃保存待檢。根據試劑盒操作步驟檢測0.5 h、4 h血清乙醇含量和4 h血清ALT、AST活性。取4 h后處死的小鼠肝臟，以1∶9比例混入生理鹽水進行液氮研磨，在4 ℃，4 500 r/min的條件下離心10 min后取上清液。取上述10%肝勻漿，使用試劑盒檢測4.0 h的ADH、ALDH、BCA、MDA、SOD和CAT水平。

1.3.5 數據處理

數據結果均以“平均值±標準差”（X±S）的表示，使用SPSS 26.0軟件對數據進行單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），以P＜0.05為依據，判斷差異是否有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 山西老陳醋對急性醉酒小鼠醉酒和醒酒時間的影響

急性酒精中毒后，小鼠由原來行動敏捷、對外界環境的改變反應敏感變為爬行不穩易摔倒，對外界刺激反應遲鈍，最終蜷縮癱倒。本研究將翻正反射消失時間即醉酒時間的長短作為評價藥物預防醉酒功效的行為學指標。山西老陳醋對急性醉酒小鼠醉酒、醒酒時間的影響見表1。

由表1可知，與模型組小鼠的醉酒相比，高劑量老陳醋組能顯著延長小鼠醉酒時間（P＜0.05），將醉酒時間由（27.71±16.27）min延長至（44.00±9.35）min；同時，高劑量老陳醋組能使醉酒小鼠快速從醉酒狀態中醒來，縮短醒酒時間（P＜0.01），將醒酒時間由原來的（200.29±73.43）min縮短至（121.25±12.71）min。攝入老陳醋后，小鼠由“快醉慢醒”轉變為“慢醉快醒”。結果表明山西老陳醋對在小鼠體內的積累的酒精有較好的代謝作用，可以通過延長醉酒時間和縮短醒酒時間起到減弱酒精麻痹，加速醒酒的作用。

表1 山西老陳醋對急性醉酒小鼠醉酒、醒酒時間的影響Table 1 Effects of Shanxi aged vinegar on drunkenness and sobering time of acute drunkenness mice

2.2 山西老陳醋對急性醉酒小鼠酒精含量的影響

肝臟是機體酒精代謝的主要器官，攝入的酒精經胃腸道吸收后分散到血液中，導致血液中的酒精含量上升，之后被輸送到肝臟中進行代謝而清除[21]。檢測血清中的酒精濃度一方面可以反映乙醇脫氫酶的活性，另一方面可以反映肝損傷程度[22]。山西老陳醋對急性醉酒小鼠血清中酒精含量的影響見表2。

表2 山西老陳醋對急性醉酒小鼠血清中酒精含量的影響Table 2 Effects of Shanxi aged vinegar on alcohol contents in serum of acute drunkenness mice

由表2可知，與空白對照組小鼠相比，模型組小鼠血乙醇體積分數在0.5 h顯著升高（P＜0.05），隨著時間延長，在4.0 h時升高更為明顯（P＜0.01）。與模型組相比，0.5 h的各劑量老陳醋組小鼠的血酒精含量無顯著差異（P＞0.05），此時老陳醋對血清中酒精含量影響較小；在4.0 h時，高劑量老陳醋組血酒精含量極顯著降低（P＜0.01），因此，高劑量醋對小鼠血清中酒精含量影響較大。

2.3 山西老陳醋對急性醉酒小鼠ADH、ALDH的影響

ADH和ALDH是體內參與酒精代謝的關鍵酶，在肝細胞的細胞質及線粒體中廣泛存在。乙醇在ADH的作用下分解為乙醛，乙醛在ALDH的作用下分解為乙酸，最終代謝成H2O和CO2，機體通過這種方式降低血液中的酒精濃度[23]。因此ADH和ALDH活性的變化可以直接影響血液中乙醇含量[24]。山西老陳醋對急性醉酒小鼠肝臟ADH、ALDH水平的影響見表3。

表3 山西老陳醋對急性醉酒小鼠肝臟ADH、ALDH水平的影響Table 3 Effects of Shanxi aged vinegar on ADH and ALDH level in liver of acute drunkenness mice

由表3可知，與空白對照組相比，模型組小鼠的ADH含量顯著降低（P＜0.05），ALDH含量極顯著降低（P＜0.01）。與模型組相比，各劑量山西老陳醋均極顯著提高小鼠ADH活性（P＜0.01），低、高劑量老陳醋組的ADH活性分別由（1.65±0.13）μg/mL升至（4.93±0.74）μg/mL、（6.08±1.24）μg/mL；而高劑量老陳醋組的ALDH活性上升較顯著（P＜0.05），由模型組的（15.12±0.82）μg/mL升至（18.6±1.70）μg/mL，因此，高劑量老陳醋組可顯著緩解小鼠的肝損傷。本實驗結果表明山西老陳醋可以通過提高ADH和ALDH的活力加快酒精在機體的代謝，降低血液中的酒精含量，起到一定的解酒作用。

2.4 山西老陳醋對急性醉酒小鼠肝組織病理形態學的影響

肝組織病理切片能較直觀地觀察肝細胞變性壞死、炎細胞浸潤等情況，判斷肝臟的損傷程度。由圖1（a）可知，與空白對照組相比，經酒精處理后的小鼠肝臟出現了明顯的病理形態學改變，表現為肝臟表面粗糙、顏色略顯泛白等。與模型組相比，經山西老陳醋處理后，上述變化有所緩解，且高劑量老陳醋組緩解效果更明顯。

圖1 急性醉酒小鼠肝臟組織形態觀察（a）與HE染色鏡檢圖（b）Fig. 1 Liver histomorphology observation (a) and HE staining microscopic examination (b) of acute drunkenness mice

由圖1（b）可知，空白對照組小鼠的肝臟經過HE染色后肝細胞狀態健康，整體無變性、壞死、充血等病變現象。模型組小鼠肝臟細胞出現大面積空泡變性和充血。攝入老陳醋后肝細胞損傷程度得到減輕，以少量空泡變性為主，病變狀態得到緩解，以高劑量老陳醋組緩解更為明顯。

2.5 山西老陳醋對急性醉酒小鼠肝功酶的影響

ALT和AST是肝中的兩種主要的轉氨酶，肝細胞受損后這兩種酶的活性提高，所以血清中ALT、AST的含量反應了肝臟的健康狀況[25-26]。山西老陳醋對急性醉酒小鼠血清中ALT、AST水平的影響見表4。

表4 山西老陳醋對急性醉酒小鼠血清中ALT、AST水平的影響Table 4 Effects of Shanxi aged vinegar on ALT and AST level in serum of acute drunkenness mice

由表4可知，模型組血清中ALT、AST水平較空白對照組顯著增高，其含量分別增高至（19.93±2.58）U/g和（24.52±2.80）U/g（P＜0.05）。與模型組相比，低劑量老陳醋的攝入顯著降低了小鼠血清中ALT、AST水平（P＜0.05），其中高劑量老陳醋的攝入使模型組高水平的ALT、AST分別降低至（12.83±3.62）U/g和（14.22±1.56）U/g（P＜0.01）。結果表明山西老陳醋對急性醉酒小鼠的肝損傷有一定的保護作用。因此，高劑量的山西老陳醋對急性醉酒小鼠血清中ALT、AST水平影響顯著。

2.6 山西老陳醋對急性醉酒小鼠肝臟CAT、SOD和MDA水平的影響

研究表明氧化應激是導致急性酒精肝損傷的發病機制之一[27]。MDA由脂質過氧化產生，MDA水平的提高可干擾抗氧化預防，引起肝臟損傷[28]。另一方面，SOD和CAT主要在機體中起抗氧化作用。SOD和CAT分別在活性氧（reactive oxygen species，ROS）和過氧化氫的催化中起作用，清除體內多余的自由基，將其轉變為水和氧排出體外[29-30]。這些抗氧化劑均能保護肝臟免受氧化應激的損害。山西老陳醋對醉酒小鼠肝臟MDA、CAT和SOD水平影響見表5。

表5 山西老陳醋對醉酒小鼠肝臟MDA、CAT和SOD水平影響Table 5 Effects of Shanxi aged vinegar on MDA, CAT and SOD level in liver of drunkenness mice

由表5可知，模型組MDA含量相較于空白對照組顯著升高至（2.89±0.39）nmol/mg（P＜0.05），與模型組相比，各劑量老陳醋組的MDA含量則有所下降，其中高劑量老陳醋組下降最明顯（P＜0.05），MDA含量由（2.89±0.39）nmol/mg下降至（2.15± 0.18）nmol/mg。模型組CAT和SOD活性較空白對照組顯著下降（P＜0.01）；與模型組相比，高劑量老陳醋組的CAT、SOD活性均顯著增強（P＜0.05）。CAT含量由（7.25±0.09）U/mg上升至（7.59±0.13）U/mg（P＜0.05）；SOD含量由（353.42±28.35）U/mg上升至（425.92±30.29）U/mg（P＜0.05）。結果表明山西老陳醋可通過減弱急性醉酒小鼠體內的氧化水平，增強抗氧化能力，改善由急性醉酒引起的肝損傷。

3 結論

山西老陳醋是一種健康發酵食品。攝入食醋能夠有效改善因急性醉酒引起的醉酒癥狀，并且能夠降低醉酒小鼠的肝功酶活性和氧化應激水平，發揮良好的護肝作用。與模型組相比，高劑量醋組可顯著延長醉酒時間至（44.00±9.35）min（P＜0.05）、醒酒時間極顯著縮短至（121.25±12.71）min（P＜0.01）；血清中乙醇含量及ALT、AST活性顯著降低為（37.01±4.24）mg/100 mL、（12.83±3.62）U/g、（14.22±1.56）U/g；肝組織中乙醇脫氫酶（ADH）活性極顯著增加（P＜0.01）、乙醛脫氫酶（ALDH）、過氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）活性顯著增加（P＜0.05），且丙二醛（MDA）含量顯著降低（P＜0.05）。食醋組肝臟病變程度減輕，切片顯示空泡面積減少。本研究揭示了山西老陳醋能緩解急性醉酒導致的AAH和肝損傷。但對于具有解酒護肝功能的保健山西老陳醋產品的開發仍需要進一步的研究。