山西老陳醋釀造過程中理化指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化及新淋醋品質(zhì)分析

陳旭峰，朱 丹，郭宏萍，康帥帥，，劉 峰，曹彥軍，許 女*

（1.黃土高原特色作物優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，山西 晉中 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030801；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，山 西太谷 030801；4.山河醋業(yè)股份有限公司，山西 和順 032700）

山西老陳醋具有紫黑明亮的色澤，口感綿柔，是一種重要的調(diào)味品[1-2]。經(jīng)發(fā)酵，山西老陳醋中積累了豐富的呈味物質(zhì)，這些物質(zhì)相互協(xié)調(diào)，賦予了山西老陳醋“綿、酸、香、甜、鮮”的風(fēng)格。同時(shí)山西老陳醋中還含有功能物質(zhì)川芎嗪，這讓山西老陳醋還具有較高的營養(yǎng)價(jià)值。山西老陳醋發(fā)酵過程主要分為酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵兩部分，在這兩個(gè)階段中會(huì)產(chǎn)生大量風(fēng)味成分，再通過山西老陳醋獨(dú)有的熏醅工藝，為老陳醋增色增香，調(diào)和五味[3]。山西老陳醋口感、滋味與其中風(fēng)味物質(zhì)的種類及含量密切相關(guān)[4]，如果能從山西老陳醋的釀造過程中找出這些復(fù)雜的呈香、呈味物質(zhì)的變化規(guī)律，將為山西老陳醋釀造過程中的代謝調(diào)控以及成品醋的品質(zhì)控制提供有力的數(shù)據(jù)支撐。

很多研究對食醋中理化指標(biāo)、有機(jī)酸含量及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行了研究。NIE Z Q等[5]研究了山西老陳醋清徐醋廠酒精發(fā)酵及醋酸發(fā)酵階段酒精度、溫度、總酸和可溶性固形物含量的變化。楊宇霞等[6]在對食醋中有機(jī)酸的差異性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)山西老陳醋中乙酸和乳酸的含量較高，其比例也具特色。呂利華等[7]對山西老陳醋有機(jī)酸進(jìn)行定性定量研究，同時(shí)優(yōu)化了山西老陳醋的檢測方法。呂艷歌等[8]對山西老陳醋醋醅中有機(jī)酸進(jìn)行檢測，主要分析了老陳醋醋酸發(fā)酵中有機(jī)酸含量變化及影響因子。苗志偉等[9]利用氣質(zhì)聯(lián)用對老陳醋進(jìn)行了定性分析，共檢測出29種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，并對色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。但目前還鮮見有學(xué)者對山西老陳醋整個(gè)釀造過程中的理化和風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行測定。因此，本實(shí)驗(yàn)主要研究了山西老陳醋整個(gè)釀造過程的理化指標(biāo)、有機(jī)酸的動(dòng)態(tài)變化，同時(shí)對新淋醋的理化指標(biāo)、有機(jī)酸含量及揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行了檢測，旨在優(yōu)化山西老陳醋的釀造工藝，改善其品質(zhì)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

對山西某醋廠的山西老陳醋整個(gè)釀造階段進(jìn)行動(dòng)態(tài)采樣。分別在酒精發(fā)酵第0、1、2、3、5、7、9、11天等距離（5 m）、等量（100 mL）從3個(gè)酒精發(fā)酵缸內(nèi)采集約300 mL的酒醪樣品，于滅菌廣口瓶中均勻混合，分別編號(hào)為AF0、AF1、AF2、AF3、AF5、AF7、AF9、AF11；醋酸發(fā)酵第0、1、3、5、7、9、10天等距離（5 m）、等量（100 g）從3個(gè)醋酸發(fā)酵缸中，距醋醅表面30 cm處，各選取4個(gè)點(diǎn)共采集約300 g剛完成翻醅的醋醅樣品于無菌自封袋中混勻，分別編號(hào)為AAF0、AAF1、AAF3、AAF5、AAF7、AAF9、AAF10；上述樣品及新淋醋樣品存放于-80 ℃保存。

1.1.2 化學(xué)試劑

草酸、丙酮酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸（均為色譜純）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

PB-21酸度計(jì)：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；戴安U3000液相色譜儀、戴安ICA-1500離子色譜儀、Trace1300氣相色譜儀、TraceISQ質(zhì)譜分析儀：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；TDL-4分析天平：北京賽多利斯天平有限公司；Eppendorf離心機(jī)：艾本德（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 理化指標(biāo)測定

酒精度、還原糖、水分、總酸、不揮發(fā)酸的測定參照國標(biāo)GB/T 19777—2013《地理標(biāo)志產(chǎn)品山西老陳醋》中的方法。

1.3.2 外標(biāo)物的制備及定量方法

參照文獻(xiàn)[10]配制草酸、酒石酸、丙酮酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸及琥珀酸共8種有機(jī)酸的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，存于4 ℃冰箱，使用時(shí)稀釋于0.22 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)樣。采用峰面積外標(biāo)法定量分析。

1.3.3 有機(jī)酸含量測定

（1）酒醪、醋醅有機(jī)酸含量測定

樣品預(yù)處理：將酒醪、醋醅樣品用去離子水浸泡3 h，抽濾，12 000 r/min離心10 min，取上清液于0.22 μm微孔濾膜濾樣后進(jìn)樣檢測。

酒醪、醋醅樣品有機(jī)酸含量測定采用高效液相色譜法，其色譜條件如下：流動(dòng)相為pH=2.7的20 mmol/L NaH2PO4；進(jìn)樣量20 μL；流動(dòng)速度0.8 mL/min；紫外檢測波長210 nm；柱溫30 ℃。

（2）新淋醋有機(jī)酸含量測定

樣品預(yù)處理[10]：新淋醋樣品用去離子水稀釋，0.22 μm微孔濾膜過濾后進(jìn)樣。

新淋醋有機(jī)酸含量測定采用離子色譜法，其色譜條件如下：IonPac AS11色譜柱（4 mm×250 mm）；流動(dòng)相20 mmol/L NaOH；進(jìn)樣量1 mL；流動(dòng)速度1 mL/min；色譜池溫度35 ℃；柱溫30 ℃；抑制器電流100 mA。

1.3.4 新淋醋品質(zhì)分析

對新淋醋的理化指標(biāo)、有機(jī)酸含量及揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行分析。揮發(fā)性香氣成分測定采用氣質(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）法。

樣品處理方法[11]：先將萃取頭在進(jìn)樣口270 ℃老化至無雜峰，然后將樣品于45 ℃孵化爐中平衡30 min，頂空吸附30 min后將萃取頭插入進(jìn)樣口，270 ℃解吸5 min，進(jìn)行樣品中揮發(fā)性香氣成分萃取。

氣相色譜條件：HP-5-MS（30 m×0.25 mm×0.25 mm）色譜柱；載氣為氦氣（He），純度99.999%；流量1 mL/min，不分流進(jìn)樣；程序升溫：初始溫度為40 ℃，保持3 min，4 ℃/min升至160 ℃保持1 min，后以10 ℃/min的速度升至270 ℃保持5 min。

質(zhì)譜條件：電子電離（electronic ionization，EI）源，接口溫度270 ℃，離子源溫度270 ℃，電子能量70 eV，掃描質(zhì)量范圍41～500 amu。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化

2.1.1 酒精發(fā)酵階段理化指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化

對山西老陳醋酒精發(fā)酵階段的理化指標(biāo)進(jìn)行測定，結(jié)果見圖1。由圖1可知，山西老陳醋酒精發(fā)酵階段酒醪溫度在整體上呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，發(fā)酵第0～1天，由于酵母菌快速繁殖，產(chǎn)生大量熱量，酒醪溫度由22 ℃迅速上升至30 ℃，而隨著發(fā)酵地進(jìn)行酒醪溫度逐漸下降，到酒精發(fā)酵末期為21 ℃。在酒精發(fā)酵第0～1天，酒醪中還原糖、可溶性固形物的含量急劇下降，分別由17.50 g/100 g、19.4%下降至3.50 g/100 g、6.0%，發(fā)酵第1～3天，還原糖的含量減少趨勢較為緩慢，可溶性固形物的含量出現(xiàn)少量增加，而后均趨于穩(wěn)定。酒精度和酸度在酒精發(fā)酵階段均呈現(xiàn)上升趨勢，發(fā)酵第0～1天，酒精度和酸度分別由0和0.29 g/100 g上升至9.3%vol和0.71 g/100 g，其中酒精度的上升趨勢最為明顯，到發(fā)酵末期時(shí)，酒精度和酸度的含量分別為8.7%vol和1.42 g/100 g。在酒精發(fā)酵第0～1天，酒醪pH下降趨勢最為明顯，由5.62急劇下降至3.13，這可能是由于酒精發(fā)酵初，酵母菌以及乳酸菌、芽孢菌等其他微生物快速生長，從而產(chǎn)生酸性代謝物質(zhì)，使得酒醪pH迅速降低，而隨著發(fā)酵，酒醪中的代謝產(chǎn)物種類和含量不斷增加，構(gòu)成了緩沖體系，使得酒醪pH在酒精發(fā)酵中期至末期呈現(xiàn)穩(wěn)定波動(dòng)變化[12]。

圖1 山西老陳醋酒精發(fā)酵階段理化指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化Fig. 1 Dynamic changes of physicochemical indexes in alcoholic fermentation of Shanxi aged vinegar

2.1.2 醋酸發(fā)酵階段理化指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化

山西老陳醋醋酸階段的理化指標(biāo)動(dòng)態(tài)變化測定結(jié)果見圖2。由圖2可知，在醋酸發(fā)酵階段，酸度呈現(xiàn)上升趨勢，由發(fā)酵初1.34 g/100 g上升至末期的5.51 g/100 g，醋酸階段是山西老陳醋釀造的主要產(chǎn)酸階段。在此階段中，不揮發(fā)酸的含量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，這可能是由于在發(fā)酵初期，微生物利用糖類產(chǎn)生了乳酸、酒石酸、琥珀酸等不揮發(fā)酸，使醋醅中不揮發(fā)酸的的含量增加，隨著發(fā)酵地進(jìn)行，發(fā)生了酯化反應(yīng)，不揮發(fā)酸的含量開始降低。還原糖和氨基氮的含量也呈現(xiàn)先增加后降低趨勢，分別在發(fā)酵第5天和第7天達(dá)到最高值，為2.86 g/100 g和0.20 g/100 g，后降至末期的0.74 g/100 g和0.17 g/100 g。醋酸發(fā)酵前加入了大量的麩皮、谷糠等輔料，在酶的作用下發(fā)生水解，使得還原糖及氨基酸態(tài)氮含量增高；而發(fā)酵后期底物被微生物利用，含量降低。水分和可溶性固形物的含量均呈現(xiàn)波動(dòng)趨勢。

圖2 山西老陳醋醋酸發(fā)酵階段理化指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化Fig. 2 Dynamic changes of physicochemical indexes in acetic acid fermentation of Shanxi aged vinegar

2.2 有機(jī)酸含量動(dòng)態(tài)變化

2.2.1 酒精發(fā)酵階段有機(jī)酸含量動(dòng)態(tài)變化

在酒精發(fā)酵階段，大量的乳酸沉積起到了改善山西老陳醋口感，減緩山西老陳醋刺激性酸味的作用[13]。除了乳酸，酒精發(fā)酵階段還產(chǎn)生其他有機(jī)酸，如酒石酸、丙酮酸、檸檬酸等[14]，多種有機(jī)酸共同賦予了山西老陳醋醇和的口感。

對山西老陳醋酒精發(fā)酵階段中有機(jī)酸含量進(jìn)行檢測，結(jié)果分別見表1和圖3。由表1和圖3可知，山西老陳醋酒精發(fā)酵階段聚為兩支，第一支為發(fā)酵第0～5天，第二支為發(fā)酵第7～11天。有機(jī)酸的總含量在整體上呈現(xiàn)出上升趨勢，由酒精發(fā)酵第0天的0.455 1 g/100 g上升到發(fā)酵末期的1.793 8 g/100 g。其中乳酸在發(fā)酵過程中含量均為最高，在發(fā)酵末期乳酸的含量達(dá)到了1.399 1 g/100 g，占有機(jī)酸總量的77.99%，在酒精發(fā)酵階段，乳酸菌作為主要微生物之一，生長繁殖旺盛，代謝產(chǎn)生了大量乳酸[15-16]，乳酸是酒精發(fā)酵階段的主體有機(jī)酸。酒精發(fā)酵階段產(chǎn)生的其他有機(jī)酸，如酒石酸、丙酮酸和琥珀酸的含量也均有增加，在酒精發(fā)酵末期其含量分別為0.0961g/100g、0.0416g/100g和0.0153g/100g；草酸、蘋果酸、乙酸和檸檬酸含量在第5天達(dá)到峰值之后略有下降，最終含量分別為0.098 7 g/100 g、0.032 9 g/100 g、0.080 8 g/100 g和0.029 2 g/100 g。桂青[17]研究表明，酒石酸和蘋果酸在酒精發(fā)酵過程中含量增加，這與本研究結(jié)果一致。

圖3 山西老陳醋酒精發(fā)酵階段有機(jī)酸含量動(dòng)態(tài)變化熱圖Fig. 3 Heat map of dynamic changes of organic acid contents during alcoholic fermentation of Shanxi aged vinegar

表1 山西老陳醋酒精發(fā)酵過程中有機(jī)酸含量動(dòng)態(tài)變化Table 1 Dynamic changes of organic acid contents during alcoholic fermentation of Shanxi aged vinegar

2.2.2 醋酸發(fā)酵階段有機(jī)酸含量動(dòng)態(tài)變化

在山西老陳醋醋酸發(fā)酵階段，大量的有機(jī)酸生成，同時(shí)還會(huì)伴有一些酯化反應(yīng)，這個(gè)過程為山西老陳醋的滋味奠定了一定的基礎(chǔ)[18-19]。

山西老陳醋醋酸發(fā)酵階段的有機(jī)酸含量變化分別見表2和圖4。由表2和圖4可知，醋酸發(fā)酵階段也聚為兩支，第一支為醋酸發(fā)酵第0～3天，第二支為第5～10天。在醋酸發(fā)酵過程中，有機(jī)酸總含量呈現(xiàn)明顯增長趨勢，發(fā)酵第0天有機(jī)酸總含量為1.2533g/100g，而到發(fā)酵末期達(dá)到了2.3048g/100g。在醋酸發(fā)酵階段，由于醋酸菌大量生長，代謝產(chǎn)生了大量乙酸，其含量在發(fā)酵第0天為0.137 4 g/100 g，至發(fā)酵末期達(dá)到了1.239 3 g/100 g，占有機(jī)酸總量的53.77%。另外乳酸的含量也較多，發(fā)酵第0天含量為0.418 0 g/100 g，發(fā)酵末期上升至0.625 6 g/100 g，占有機(jī)酸總量的27.14%。該兩種酸為山西老陳醋醋酸發(fā)酵階段的主體有機(jī)酸。琥珀酸的含量在發(fā)酵第7天達(dá)到最高值0.210 3 g/100 g后開始下降，到發(fā)酵末期時(shí)降為0.045 4 g/100 g。丙酮酸、蘋果酸和檸檬酸的含量均有下降，至發(fā)酵末期時(shí)含量分別為0.008 0 g/100 g、0.0493g/100g和0.0005g/100g。其他有機(jī)酸含量變化不明顯。

圖4 山西老陳醋醋酸發(fā)酵階段有機(jī)酸含量動(dòng)態(tài)變化熱圖Fig. 4 Heat map of dynamic changes of organic acid contents during acetic acid fermentation of Shanxi aged vinegar

表2 山西老陳醋醋酸發(fā)酵過程中有機(jī)酸含量動(dòng)態(tài)變化Table 2 Dynamic changes of organic acid contents during acetic acid fermentation of Shanxi aged vinegar

2.3 新淋醋的品質(zhì)分析

2.3.1 新淋醋的理化指標(biāo)

對新淋醋樣品的理化進(jìn)行檢測，結(jié)果見表3。由表3可知，新淋醋樣品中的還原糖、可溶性固形物及氨基氮的含量分別為1.59 g/100 mL、9.7%及0.11 g/100 mL，pH值、酸度以及不揮發(fā)酸分別為3.68、5.29 g/100 mL和1.93 g/100 mL。

表3 山西老陳醋新淋醋中基礎(chǔ)理化指標(biāo)測定結(jié)果Table 3 Determination results of basic physicochemical indexes of new leaching vinegar of Shanxi aged vinegar

2.3.2 新淋醋中有機(jī)酸

新淋醋樣品中各有機(jī)酸含量檢測結(jié)果見表4。由表4可知，樣品中各有機(jī)酸總含量為31.017 2 g/L，其中乙酸的含量最高，為20.983 0 g/L，占有機(jī)酸總含量的67.65%。乳酸含量次之，為8.184 5 g/L，占有機(jī)酸總含量的26.39%。王芮東等[20]研究表明，乙酸為食醋酸味的主要來源，且山西老陳醋中乙酸的含量占有機(jī)酸總量的51.57%，是山西老陳醋的主要呈酸物質(zhì)。

表4 山西老陳醋新淋醋中有機(jī)酸測定結(jié)果Table 4 Determination results of organic acids contents in new leaching vinegar of Shanxi aged vinegar

2.3.3 新淋醋中揮發(fā)性香氣成分

采用頂空固相微萃取（headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）結(jié)合氣-質(zhì)聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術(shù)，對新淋醋中揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行檢測，其總離子流色譜圖見圖5，揮發(fā)性香氣成分含量檢測結(jié)果見表5。

圖5 新淋醋揮發(fā)性香氣成分GC-MS分析總離子流圖Fig. 5 Total ion chromatogram of volatile aroma compounds in new leaching vinegar analysis by GC-MS

表5 新淋醋中揮發(fā)性香氣成分測定結(jié)果Table 5 Determination results of volatile aroma components in new leaching vinegar

續(xù)表

由圖5和表5可知，在新淋醋樣品中共檢測出13種酯類、2種醇類、1種酸類、7種醛類、12種雜環(huán)類，共35種揮發(fā)性香氣成分。新淋醋樣品中雜環(huán)類香氣成分的總相對含量最高，為43.20%，其中糠醛和四甲基吡嗪為主要成分，相對含量分別為38.87%和2.37%。酯類、酸類、醛類香氣成分含量較高，其相對含量分別為7.19%、13.88%、6.95%，山西老陳醋中的酯類物質(zhì)大多具有果香和乳香，賦予了山西老陳醋，醛類物質(zhì)具有一定的焦香味，起到了調(diào)和山西老陳醋無味的作用[21-22]。同時(shí)新淋醋樣品中還含有一定的醇類香氣成分，包括了2,3-丁二醇和苯乙醇，總相對含量為3.85%，其中苯乙醇的含量較多，為2.75%。苯乙醇由酵母菌代謝產(chǎn)生，具有蜂蜜香味，起到了改善山西老陳醋的風(fēng)味的作用[23]。上述風(fēng)味物質(zhì)共同存在，相互調(diào)和，構(gòu)成了山西老陳醋的獨(dú)特風(fēng)格，使得老陳醋酸口感醇和，酸綿幽香[24-25]。

3 結(jié)論

本研究對山西老陳醋釀造過程中理化指標(biāo)、有機(jī)酸含量進(jìn)行了動(dòng)態(tài)監(jiān)測，研究其變化規(guī)律，并對新淋醋中理化指標(biāo)、有機(jī)酸含量及揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行分析。結(jié)果表明，酒精發(fā)酵階段，酒精度、酸度和有機(jī)酸呈上升趨勢，還原糖含量呈下降趨勢。醋酸發(fā)酵階段酸度和有機(jī)酸含量不斷增長，還原糖和氨基氮的含量先上升后下降。新淋醋理化指標(biāo)符合相關(guān)國標(biāo)，有機(jī)酸總含量為31.017 2 g/L，共檢測到35種揮發(fā)性香氣成分，其中酯類、醇類、揮發(fā)性酸、醛類和雜環(huán)類化合物相對含量分別為7.19%、3.85%、13.88%、6.95%和43.20%。本研究對優(yōu)化山西老陳醋釀造工藝，指導(dǎo)代謝控制提質(zhì)增效起到重要意義。山西老陳醋是一個(gè)非常復(fù)雜的體系，多種物質(zhì)共同作用賦予了其特有的風(fēng)味。而在山西老陳醋發(fā)酵和陳釀的過程中，很多風(fēng)味物質(zhì)的代謝通路還不是十分明確，有待進(jìn)一步研究。