醋蛋液對巨噬細胞RAW264.7免疫調節活性的影響

柳昊睿，邱 瑜，牟芳茗，耿曉琦，宋 佳*

（天津科技大學生物工程學院工業發酵微生物教育部重點實驗室天津市微生物代謝與發酵過程控制技術工程中心，天津 300457）

醋蛋液作為我國一種傳統食品，是一種藥食兼用的飲品。醋蛋液是我國民間流傳很久的一種食療食品，我國也是世界上最早使用醋蛋液進行保健的國家[1]。我們的祖先早已有用食醋浸泡雞蛋來治療某些疾病的先例。許多民間偏方也常用醋蛋液預防治療腮腺炎、灰指（趾）甲、毒蟲叮咬、腰腿痛等癥，所以自古就有“醋蛋治百病”之說[2-5]。近年來，有關醋蛋醫療保健以及藥理作用的研究報道越來越多。中醫理論認為，食醋性溫味酸苦，有開胃、養肝、散瘀、止痛等功效[6]。雞蛋味甘性平，有補中益氣、養陰定驚等作用[7]。兩者結合形成的醋蛋液具有抗氧化、降脂降壓、抑菌等主要功能，對失眠和食欲不振等多種常見疾病有良好的效果，深受醫學專家推崇[8]。

巨噬細胞來源于單核細胞，作為一種多功能效應細胞，在免疫系統中具有防御及調節功能[9-10]。巨噬細胞最重要的功能是吞噬功能，它可以通過直接吞噬外來抗原、損傷衰老細胞以及病原微生物進而起到免疫清除的作用，從而實現機體內環境穩定。除此之外可以通過呈遞抗原和分泌不同的活性物質參與機體的免疫應答過程，主要表現在對先天免疫應答中的重要作用[11]。CHEONG K T等[12]通過免疫調節實驗表明，從冬蟲夏草中分離得到的多糖可以顯著改善巨噬細胞的細胞增殖和吞噬能力，并且通過激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和核因子-κB（nuclear factor，NF-κB）信號通路釋放一氧化氮（nitrogen oxide，NO）和細胞因子從而提高機體的免疫能力。此外還有研究表明，甘草多糖還可以通過增加巨噬細胞體積，使其偽足增多，提高其表面積起到調節細胞的免疫作用[13]。

醋蛋液可以激活免疫細胞，促進細胞因子的分泌，提高機體免疫力進而增強機體的抗感染及抗腫瘤能力。醋蛋液作用于U937細胞，可以促使其分泌大量細胞因子如白細胞介素（interleukin，IL-1β）、干擾素（interferon，IFN-γ）、腫瘤壞死因子（tumour necrosis factor，TNF-α）及NO，起到免疫調節作用進而誘導U937細胞分化，抑制其生長起到治療白血病的作用[14]。韋玉先等[15]的動物實驗表明，醋蛋液能明顯促進動物腸的蠕動，升高白細胞以及肝臟中鋅的含量，提高細胞免疫功能且實驗結果未發現醋蛋液有任何不良的影響。

為了探究醋蛋液對巨噬細胞RAW264.7的免疫調節活性，本研究采用細胞計數試劑盒（cell counting kit，CCK）-8法來檢測不同劑量的醋蛋液對小鼠巨噬細胞RAW264.7免疫活性的影響，倒置顯微鏡及熒光顯微鏡下分別觀察不同分組條件下對RAW264.7細胞形態的影響及細胞核的損傷程度，探討醋蛋液對RAW264.7細胞分泌免疫因子的影響及其免疫調節活性的機理。以期對傳統食品的研究和應用、對免疫調節類藥物的開發提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮雞蛋：天津農貿市場；8°梁汾醋：山西梁汾醋業有限公司；RAW264.7巨噬細胞：中科院武漢細胞庫；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒、NO試劑盒：南京建成生物科技有限公司；IL-1β、TNF-α試劑盒：上海酶聯生物科技有限公司；無線電免疫沉淀反應試驗（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液、JC-1染液、AnnexinV/PI結合液、DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）完全培養基、胰酶（625 U/mL）：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；Hoechst33342染料：德國Hoechst AG公司；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）：愛必信（上海）生物科技有限公司；CCK-8：北京盒子生工科技有限公司。

1.2 儀器與設備

3110 CO2細胞培養箱：美國Thermo有限公司；1X2-1LLJ100普通光學顯微鏡：日本Olympus有限公司；TE2000倒置熒光顯微鏡：日本Nikon有限公司；C6多功能細胞分析儀：美國BD有限公司；XH-600US 超聲波細胞破碎儀：美國Sonics有限公司；1703930電轉膜儀：美國Bio-Rad有限公司；Odyssey紅外激光成像儀：美國LI-COR生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 醋蛋液的制備

選擇一個新鮮雞蛋，用水和體積分數75%乙醇清洗干凈，在4 ℃條件下用100 mL 8°梁汾醋浸泡72 h后將蛋液攪拌均勻，充分混合均勻后用兩層消毒紗布過濾以除去破碎的蛋膜，置于8 000 r/min條件下離心15 min，取上清液即為醋蛋液，制備的樣品保存在20 ℃備用。

1.3.2 醋蛋液劑量篩選

利用CCK-8試劑盒法檢測細胞活性從而對醋蛋液的劑量進行篩選。取對數生長期的巨噬細胞RAW264.7約5×104個/mL接種至96孔板中，每孔加入量為100 μL，在不同孔中加入不同質量濃度的樣品（2.5 μL/mL、5.0 μL/mL、10.0μL/mL、20.0μL/mL、40.0μL/mL、50.0μL/mL、100.0μL/mL）處理RAW264.7細胞。將96孔板置于37 ℃、5%CO2條件下培養24 h后每孔加入CCK-8溶液10 μL，37 ℃培養箱中避光孵育4 h，終止培養，檢測波長450 nm處各孔吸光度值，每個濃度組設置3個平行。細胞活力計算公式如下：

式中：A加藥為檢測孔（含有細胞、CCK-8和藥物溶液）吸光度值；A空白為空白孔（含有培養基和CCK-8溶液）吸光度值；A未加藥為空白對照孔（含有細胞和CCK-8溶液）吸光度值。

1.3.3 細胞分組及實驗設計

巨噬細胞RAW264.7分成空白組（加入DMEM完全培養基）、乙酸加雞蛋組（其中乙酸含量參考梁汾醋中含量，浸泡過程如醋蛋液浸泡過程）、水加雞蛋組、梁汾醋加雞蛋高劑量組（醋蛋液高劑量組）（20 μL/mL）、梁汾醋加雞蛋低劑量組（醋蛋液低劑量組）（5 μL/mL）、對照組（加入1 μg/mL的LPS）。

1.3.4 細胞形態觀察

取對數生長期的巨噬細胞RAW264.7接種于6孔培養板，置于37 ℃、5%CO2條件下培養24 h后倒去上清液，不同孔中加入不同分組的培養液繼續培養24 h后吸去上層細胞培養液，放置在倒置熒光顯微鏡下觀察不同分組條件下的細胞形態變化。

1.3.5 培養液中細胞免疫及體液免疫因子的測定

取對數生長期的細胞RAW264.7接種于6孔培養板，置于37 ℃、5%CO2條件下培養24 h后倒去上清液，空白組、對照組和不同濃度的醋蛋液劑量組中分別加入不同的培養液繼續培養24 h，吸取細胞培養液，置于離心機中1 000 r/min離心10 min，取上清液按照NO、IL-1β、TNF-α試劑盒的方法測定培養液中細胞免疫以及體液免疫因子的含量。

1.3.6 細胞核損傷檢測

取培養至對數生長期的巨噬細胞RAW264.7，按照5×104個/mL的濃度接種在6孔板中，將不同濃度的醋蛋液樣品溶液或LPS處理RAW264.7細胞，置于37 ℃、5%CO2條件下培養24 h。隨后倒去上清液每孔中加入2 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS），此外再向每孔中加入1 μL 1 mg/mL的Hoechst33342染料，37 ℃、5%CO2的培養箱中避光孵育5 min，隨后終止培養。吸去染液后用預冷PBS緩緩沖洗細胞2～3次，在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞核的損傷情況，并進行拍照。

1.3.7 線粒體膜電位的分析

將培養至對數生長期的RAW264.7細胞以5×104個/mL的密度接種于6孔板中，使用不同濃度的醋蛋液或LPS處理RAW264.7細胞，置于37 ℃、5%CO2條件下培養。用DMEM完全培養基將JC-1染液稀釋至質量濃度為5 μg/mL的工作液，每孔2 mL體系，在細胞培養箱37 ℃條件下孵育20 min，去除細胞上清，事先預冷的PBS緩緩沖洗細胞兩次，為防止熒光淬滅需要在1 h內完成觀察拍照。

1.3.8 AnnexinV/PI細胞凋亡檢測

將培養至對數生長期的RAW264.7細胞以5×104個/mL的密度接種于6孔板中，使用不同濃度的醋蛋液或LPS處理RAW264.7細胞，置于37 ℃、5%CO2條件下培養。用200 μL胰酶消化RAW264.7細胞，收集每孔細胞，4 000 r/min離心5 min，用預冷的PBS沖洗2～3次。首先用0.5 mL AnnexinV/PI結合液重懸細胞，后加入5 μL AnnexinV染液，混勻，低溫避光條件下孵育15 min；隨后再向其中加入5 μL PI染液，混和均勻，低溫避光條件下再孵育5 min，此外單獨設置單染組以及陽性對照組，防止熒光淬滅需在1 h內上機完成檢測。

1.3.9 蛋白免疫印跡檢測

將收集好的細胞放入離心管內，4 000 r/min條件下離心5 min，棄去上清后加入1 mL預冷PBS緩沖液重懸，重復以上操作過程洗滌兩次，將樣品放于冰上。加入0.1 mLRIPA裂解液和1 μL苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）溶液，反復吹打后在冰上充分裂解30 min，期間每隔10 min渦旋一次。低溫環境下12 000 r/min離心5 min，采用BCA試劑盒測定制備樣品中的總蛋白含量并將樣品調成相同濃度，按照樣品∶蛋白緩沖液=1∶4的比例加入5倍的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖溶液并將其混合均勻。100 ℃沸水中反應8 min后冷卻離心，取上清按分組分裝在500 μL離心管中，放置在-80 ℃環境中保存備用。隨后進行凝膠電泳，轉膜，孵育相應蛋白對應的一抗與二抗。最后聚偏二氟乙烯（polyvinylidenefluoride，PVDF）膜用Odyssey紅外激光成像系統進行成像。用Image J v1.8.0軟件對目標帶的分子質量和凈光密度值進行數據分析。

1.3.10 數據處理

每個樣品數據集至少重復3次，使用SPSS 20.0軟件進行方差分析和Tukey相關分析。用Origin 9.0繪制圖形，實驗數據以“平均數±標準差”表示，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 醋蛋液對RAW264.7細胞活性的影響

由圖1可知，醋蛋液的濃度范圍為2.5～100 μL/mL時，巨噬細胞活性呈現先上升后下降的趨勢；當醋蛋液濃度為40 μL/mL時，細胞活力極顯著升高為（145.3±23.02）%（P＜0.01）。在此之前，當醋蛋液濃度在5～20 μL/mL之間時，細胞活力已經出現了顯著差異（P＜0.05）。因此，選擇5 μL/mL和20 μL/mL作為低、高劑量進行后續研究。

圖1 不同濃度的醋蛋液對巨噬細胞RAW264.7細胞活力的影響Fig. 1 Effect of different concentrations of vinegar egg-juice on cell viability of macrophages RAW264.7

2.2 醋蛋液對RAW264.7細胞形態的影響

由圖2可知，正常分組條件下細胞輪廓清晰，呈現較為規則的圓形且增殖能力良好。給藥一定劑量的乙酸、雞蛋以及醋蛋液后巨噬細胞開始出現較低程度的變形，細胞開始呈現梭形以及橢圓形并逐漸長出偽足。乙酸、雞蛋以及醋蛋液低劑量（5 μL/mL）組間差異不大，但醋蛋液高劑量組（20 μL/mL）相比低劑量組形態變化明顯。給藥LPS后細胞體積明顯變大，呈現不規則狀態且具有較高程度的變形，出現較多的突觸細胞以及長梭形細胞。細胞膜破損導致細胞液外泄，折光性變差，并可見伸展性較好的偽足。形態結果顯示給藥LPS可以使巨噬細胞產生典型的炎癥相關形態特征并進一步誘發巨噬細胞的炎癥相關形態學特征。

圖2 醋蛋液對巨噬細胞RAW264.7細胞形態的影響Fig. 2 Effect of vinegar egg-juice on cell morphology of macrophages RAW264.7

2.3 醋蛋液對RAW264.7細胞相關指標的影響

激活后的巨噬細胞可以分泌出不同的趨化因子及細胞因子，在激活機體的適應性免疫和調節免疫反應方面起著非常重要的作用。其中主要由活化的巨噬細胞產生的白細胞介素-1（IL-1）是趨化因子家族的一種細胞因子可以分為IL-1α與IL-1β兩種構型。其中IL-1可以激活并參與調節免疫細胞，介導T細胞與B細胞的活化、增殖與分化的過程，在傳遞信息、免疫反應中起著重要作用[16]。抗腫瘤因子（TNF-α）是一種對腫瘤細胞有殺傷作用而對正常細胞無明顯毒性的細胞因子，屬于TNF超家族配體。TNF-α是一種多向性的促炎細胞因子，主要由活化的巨噬細胞分化，在自身免疫疾病，類風濕關節炎以及炎癥中有著至關重要的作用[17]。

由圖3可知，與空白組相比，雞蛋組與醋蛋低劑量組（5 μL/mL）上清中IL-1β以及TNF-α均未有顯著差異（P＞0.05）。但孵育高劑量的醋蛋液（20 μL/mL）和LPS可以顯著提高細胞免疫因子IL-1β以及TNF-α的釋放（P＜0.05）。與空白組相比，高劑量的醋蛋液組（20 μL/mL）對巨噬細胞分泌IL-1β以及TNF-α的含量分別提高了155.83%和8.81%。一定程度上表明醋蛋液具有一定的免疫調節作用。

圖3 醋蛋液對巨噬細胞RAW264.7分泌免疫因子IL-1β（A）、TNF-α（B）及NO（C）的影響Fig. 3 Effect of vinegar egg-juice on secretion of immune factor IL-1β (A), TNF-α (B) and NO (C) of macrophages RAW264.7

NO是由巨噬細胞分泌的一種具有生物活性的細胞信使因子，由NO合成酶（nitric oxide synthase，NOS）合成，是一種具有氧化性能的自由基[18]。NO具有殺滅病原微生物的作用，能夠導致腫瘤細胞的凋亡，具有較強的殺傷能力。因而NO被認為是一種細胞內信使分子可以介導各種生物反應的發生，其分泌量是巨噬細胞的免疫活性的評價指標之一。由圖3C可知，醋蛋液高劑量組（20 μL/mL）以及LPS組均可以促進巨噬細胞分泌NO，而其他分組孵育巨噬細胞無明顯差異（P＞0.05）。

2.4 醋蛋液對RAW264.7細胞核形態的影響

由圖4可知，通過熒光顯微鏡可以看到乙酸組、雞蛋組以及醋蛋低劑量組（5 μL/mL）與空白組無顯著性差異（P＞0.05），屬于細胞的正常凋亡。但醋蛋高劑量組（20μL/mL）細胞核染色質濃縮成塊或核破碎的情況減少，凋亡細胞數明顯減少，有效緩解了細胞損傷程度。隨著醋蛋液劑量在5～20 μL/mL增高，細胞損傷情況逐漸緩解，呈現一定的量效關系。LPS誘導的巨噬細胞細胞核脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）出現明顯的損傷，并進一步加重核破裂和核染色質濃縮，細胞膜逐漸呈現損傷，結構模糊不清。

圖4 醋蛋液對巨噬細胞RAW264.7細胞核形態的影響Fig. 4 Effect of vinegar egg-juice on cell nuclear morphology of macrophages RAW264.7

2.5 醋蛋液對RAW264.7細胞線粒體膜電位的影響

JC-1是一種用于檢測細胞及組織線粒體膜電位變化的熒光探針，JC-1染料以電勢依賴性的方式聚集在線粒體內，可以通過紅綠熒光的變化進行細胞、組織或鈍化的線粒體膜電位的監測[19-20]。由圖5可知，正常巨噬細胞線粒體中JC-1以聚合物的形式存在，呈現明亮的紅色熒光，細胞中的綠色熒光非常弱。加入LPS后在線粒體基質中JC-1不能以聚合物的形式存在，會導致線粒體膜電位下降，從而線粒體內紅色熒光強度顯著降低（P＜0.05），而細胞漿中綠色熒光顯著增強（P＜0.05）。此外紅/綠熒光的相對比率的顯著降低（P＜0.05），進一步表明線粒體功能受到障礙，細胞受損。與正常組的巨噬細胞相比，乙酸組、雞蛋組以及醋蛋低劑量組（5 μL/mL）無顯著性差異（P＞0.05），屬于正常的細胞損傷過程。但乙酸組的紅/綠熒光的相對比率相對較低，可能是由于乙酸對細胞具有一定的刺激作用，導致細胞膜電位變低。隨著醋蛋液劑量的增加，醋蛋液高劑量（20 μL/mL）處理的細胞與正常的巨噬細胞以及LPS處理的細胞相比細胞內的綠色熒光強度逐漸減弱，紅色熒光逐漸增強，可以緩解細胞膜電位降低造成的細胞損傷。崔曉楓[21]研究發現，黃傘菌的次級代謝產物在質量濃度為100 μg/mL時作用于巨噬細胞RAW264.7，細胞核出現致密濃染且有顏色發白的碎片的現象。且經過黃傘菌次級代謝產物孵育后紅色熒光逐漸減少，綠色熒光逐漸增加，膜電位下降，對巨噬細胞有一定的損傷作用。

圖5 醋蛋液對巨噬細胞RAW264.7細胞膜電位的影響Fig. 5 Effect of vinegar egg-juice on cell membrane potential of macrophages RAW264.7

2.6 醋蛋液對RAW264.7細胞凋亡的影響

由圖6可知，右下象限和右上象限分別表示凋亡細胞和壞死細胞，左下象限表示活細胞。乙酸與LPS處理后的細胞凋亡率（膜聯蛋白V+細胞/總細胞）顯著上升（P＜0.05），分別達到（25.5±1.89）%和（29.3±3.01）%，說明乙酸以及LPS均對巨噬細胞有一定的損傷作用。雞蛋處理的巨噬細胞與正常細胞無異，高劑量的醋蛋液（20 μL/mL）可減少細胞的凋亡，可緩解巨噬細胞的凋亡，對細胞具有一定的保護作用。且隨著醋蛋液劑量的增加，保護效果越明顯，具有一定的量效關系。介怡琳等[22]也研究發現，從雞蛋蛋黃中提取的不同濃度的卵黃高磷蛋白均可以促進巨噬細胞RAW264.7的增殖并起到抑制細胞凋亡的作用，但質量濃度為100 μg/mL時效果最佳。

圖6 醋蛋液對巨噬細胞RAW264.7細胞凋亡的影響Fig.6 Effect of vinegar egg-juice on apoptosis of macrophages RAW264.7

2.7 醋蛋液對RAW264.7細胞免疫相關蛋白表達的影響

醋蛋液對巨噬細胞RAW264.7免疫相關蛋白（蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）、磷酸化蛋白激酶B（phosphorylation of protein kinase B，P-AKT）、NF-κB、磷酸化（P）-NF-κB、3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehydes-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH））表達情況見圖7。

圖7 醋蛋液對免疫相關蛋白表達水平的影響Fig. 7 Effect of vinegar egg-juice on expression levels of immune-associated protein

由圖7可知，給藥高劑量醋蛋液（20 μL/mL）以及雞蛋，巨噬細胞中AKT以及NF-κB的蛋白表達量明顯高于空白組但相比LPS組較低。一定程度上表明醋蛋液和雞蛋都具有一定的免疫調節活性，但醋蛋液的效果明顯高于雞蛋。與空白組相比，醋蛋液高劑量組（20 μL/mL）對AKT及NF-κB的蛋白表達量分別增加了28.98%和31.27%。這些結果說明激活NF-κB和AKT通路參與醋蛋液激活巨噬細胞，進而調節機體免疫[23-25]。

3 結論

本研究考察了不同劑量醋蛋液對巨噬細胞細胞形態和細胞核形態的影響，結果表明，高劑量醋蛋液（20 μL/mL）可使細胞折光性變強，細胞形態變化明顯；高劑量醋蛋液可以明顯減少細胞凋亡的數量，有效緩解了細胞核損傷程度；高劑量醋蛋液可顯著增強細胞免疫因子IL-1β以及TNF-α的釋放。高劑量醋蛋液可提高巨噬細胞中NF-κB和AKT關鍵蛋白表達量，其分別上調了28.98%和31.27%，表明高劑量醋蛋液通過激活免疫通路，以強化巨噬細胞免疫能力。此研究對免疫調節類藥物的開發提供了新思路，在未來醫藥領域潛力巨大，同時對傳統食品的研究和應用提供了新思路。