模糊數學感官評價結合響應面法優化黑枸杞-刺梨風味發酵乳發酵工藝

賈慶超，梁艷美

（1.鄭州科技學院食品科學與工程學院，河南 鄭州 450064；2.安陽工學院計算機科學與信息工程學院，河南 安陽 450064）

發酵乳是以生牛乳或乳粉為原料，經殺菌、發酵后制成的pH值降低的產品[1]。發酵乳發酵后，牛奶中的鈣被轉化為水溶性鈣，很容易被機體所吸收利用[2]。發酵乳制品可以增強人體免疫力、調節機體生理、預防疾病。目前市場上發酵乳的種類很多，如莫斯利安、安慕希等，但風味型發酵乳卻非常少，所以研制風味型發酵乳具有重要的意義。

黑枸杞（Lycium ruthenicumMurr.）具有保護皮膚屏障、降低血壓、增強人體免疫力、降低膽固醇、抑制腫瘤、抗氧化等藥理功效[3-7]。刺梨（Rosa roxbunghii）多生長在云南、貴州地區，含有豐富的維生素C、總黃酮、多糖和超氧化物歧化酶等活性物質，具有促進胃腸道消化，提高人體免疫力、抗氧化、延緩衰老等功效[8-12]。

本研究以刺梨干果、黑枸杞、純牛奶為原料發酵制備一款風味發酵乳，以感官評分、蛋白質含量為響應值，采用模糊數學感官評價結合響應面優化法對其發酵工藝進行優化，并對發酵乳的感官、理化及微生物指標進行檢測，這不僅開發了刺梨的市場前景，同時也為黑枸杞刺梨發酵型乳飲料的發展提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

黑枸杞：寧夏寧安堡土特產品有限公司；刺梨：深圳貳拾貳號工坊食品有限公司；純牛奶（蛋白質3.4 g/100 mL）：江蘇光明銀寶乳業有限公司；菌種ABY-10（200 U/袋）：丹尼斯克（中國）有限公司。

1.1.2 培養基MRS、MC培養基：青島海博生物技術有限公司；孟加拉紅、平板計數瓊脂：北京陸橋技術股份有限公司。

1.1.3 試劑

蔗糖（食品級）：云南滇鵬糖業有限公司；增稠劑（食品級）：丹尼斯克（中國）有限公司；氫氧化鈉、乙酸鉛、磷酸氫二鈉、濃硫酸、硫酸銅、氨水、鹽酸萘乙二胺、亞硝酸鈉、硫酸鉀、乙醚、石油醚、甲醇、乙腈、辛烷磺酸鈉（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；三聚氰胺標準品（純度＞99%）：武漢中昌國研標物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SPECORD 210紫外可見分光光度計：德國耶拿分析儀器股份有限公司；Kjeltec8400全自動凱式定氮儀：丹麥福斯分析儀器有限公司；1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀、7890B氣相色譜（gas chromatography，GC）儀：美國安捷倫有限公司；PHB-4型pH計：上海精科儀器有限公司；XG1.CD-300M臥式滅菌鍋：山東新華醫療器械有限公司；XPE205DR分析天平：瑞士梅特勒托利多公司；N1-50全自動氮吹濃縮儀：廣州儀德精密科學儀器股份有限公司；SPX-250B-Z生化培養箱：上海博訊醫療生物器械有限公司；FT1乳品快速分析儀：丹麥福斯公司；DH3600B Ⅱ電熱恒溫培養箱：天津市泰斯特儀器有限公司；BX53F顯微鏡：德國蔡司股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 黑枸杞-刺梨風味發酵乳的制備工藝

操作要點：

黑枸杞汁的制備：選取果實飽滿、外表無損壞、無發霉變質的優質黑枸杞，去除雜質，放入純水中清洗干凈，晾干，按照料液比1∶15[13]的比例混合后放入破碎打漿機中打漿，升溫至70 ℃浸提4 h，用80目過濾塞過濾，即得黑枸杞汁。

刺梨汁的制備：挑選個大且有光澤、無損壞的刺梨干果，去蒂，用純水清洗干凈，晾干，將刺梨與水按照1∶10的比例混合，放入破碎打漿機中打碎，加熱至微沸浸提35 min，用80目過濾塞過濾，即得刺梨汁。

混合：以發酵乳的總質量為基準，在牛奶中添加5%刺梨汁、12%黑枸杞汁、5%蔗糖、0.06%增稠劑，混勻。

均質：常溫下采用均質機1 200 r/min均質15 min。

滅菌、冷卻：將混合液在70 ℃水浴鍋中滅菌15 min，并冷卻至40 ℃。

接種：在滅菌、冷卻后的40℃混合液中加入菌種ABY-10 0.002%，攪拌均勻，覆蓋保鮮膜隔氧。

發酵：將混合液置于43 ℃恒溫條件下發酵5 h，待混合液由液態變為固態凝乳，滴定酸度達到70 T°即為發酵完成。

后熟：將發酵后的發酵乳放于4～6 ℃的冰箱中后熟12 h，即得成品。

1.3.2 黑枸杞-刺梨風味發酵乳發酵工藝優化單因素試驗

按照黑枸杞-刺梨風味發酵乳發酵工藝，依次考察黑枸杞汁添加量（6%、8%、10%、12%、14%）、刺梨汁添加量（3%、5%、7%、9%、11%）、蔗糖添加量（4%、5%、6%、7%、8%）、發酵時間（4 h、5 h、6 h、7 h、8 h）、菌種ABY-10接種量（0.001%、0.002%、0.003%、0.004%、0.005%）對黑枸杞-刺梨風味發酵乳感官評分及蛋白含量的影響，確定枸杞汁添加量、刺梨汁添加量、蔗糖添加量、發酵時間、菌種ABY-10接種量。

1.3.3 黑枸杞-刺梨風味發酵乳的感官評價

所選擇的10位感官評價人員為光明乳業實驗中心經過感官評價培訓的人員，把經過后熟后的黑枸杞-刺梨風味發酵乳倒入透明的玻璃試吃杯中，在采光良好的實驗室內觀察發酵乳的色澤，輕輕搖動品嘗杯并觀察發酵乳的組織狀態，仔細聞氣味，每次感官評價前應先用溫開水漱口，評價前12 h不可以吃辛辣刺激性食物，評價人員無生理感官缺陷，評價期間不互相討論，保證客觀真實評價。具體評價標準見表1。

表1 黑枸杞-刺梨風味發酵乳的感官評價標準Table 1 Sensory evaluation standards of fermented black wolfberry-Rosa roxburghii flavor milk

1.3.4 模糊數學感官評價模型的建立（1）因素集和評語集的建立

以色澤（U1）、狀態（U2）、滋味（U3）和氣味（U4）4個評價指標組成黑枸杞-刺梨風味發酵乳的評價因素集，即U=（色澤U1，狀態U2，滋味U3，氣味U4）。以優V1、良V2、中V3、差V4組成對黑枸杞-刺梨風味發酵乳每個因素的評語集，即V=（優V1，良V2，中V3，差V4）。

（2）權重集的確定

方法采用用戶調查法和二元對比法確定每個指標的權重[14-15]，邀請10位經過培訓的感官評價人員對影響黑枸杞-刺梨風味發酵乳的因素項目重要性進行投票，通過影響因素的兩兩比較，認為重要的得1票，次要的得0票，自身對比得1票，1票即為1分，各項指標的得票數占各指標的總票數的比率即為各指標所占的權重，各因素的權重分布見表2。

表2 各因素的權重分布Table 2 Weight assignment of each factor

根據統計結果，權重集M=（M1，M2，M3，M4）=（0.35，0.25，0.14，0.26），其中M1、M2、M3、M4分別為風味發酵乳的評價指標滋味、氣味、色澤、狀態的權重。

（3）模糊矩陣的建立及評價結果的確定

邀請10名感官評價人員根據感官評價標準，對黑枸杞-刺梨風味發酵乳的各個因素進行感官評價，計算出各個影響因素在優、良、中、差四個等級中的票數分布，將各個因素得票數分別除以感官評價總人數10，即可得到yij（i=1，2，…n；j=1，2…m），所以根據得票結果，第k號試驗樣品的模糊矩陣建立如下：

k為第k號試驗樣品，根據模糊矩陣的變換的原理，感官評價的綜合評價結果P的計算公式為：P=M×Uk，為了得到k號試驗樣品的準確的感官評分，將感官評價標準中的優、良、中、差分別賦值為90分、80分、70分、60分，將感官評價結果P值與相應的賦值相乘，再相加，即可得到最終的k號樣品的感官評分Y。

1.3.5 黑枸杞-刺梨風味發酵乳發酵工藝優化響應面試驗[16-18]

在單因素試驗基礎上，確定黑枸杞汁的添加量為12%，以感官評分（R1）、蛋白質的含量（R2）為響應值，選取影響較大的因素刺梨汁添加量（A）、菌種接種量（B）、發酵時間（C）和蔗糖添加量（D）為考察因素，采用Design-Expert10.0.7軟件，根據Box-Behnken設計原理，進行4因素3水平的響應面優化試驗，試驗因素與水平見表3。

表3 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 3 Factors and levels of Box-Behnken experiments design

1.3.6 黑枸杞-刺梨風味發酵乳品質的測定

（1）理化指標的測定

脂肪含量的測定：參照GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》中的堿水解法；蛋白質含量的測定：參照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》中的凱氏定氮法；乳糖、蔗糖含量的測定：參照GB 5413.5—2010《嬰幼兒食品和乳品中乳糖、蔗糖的測定》中的萊因-埃農氏法；酸度的測定：參照GB 5009.239—2016《食品酸度的測定》中的酚酞指示劑法；水分含量的測定：參照GB5009.3—2016《食品中水分的測定》中的直接干燥法；脂肪非脂乳固體的測定：參照GB5413.39—2010《乳和乳制品中非脂乳固體的測定》；亞硝酸鹽含量的測定：參照GB 5009.33—2016《食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》中的分光光度計法；三聚氰胺含量的測定：參照GB/T 22388—2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》中的HPLC法。

（2）微生物指標的測定

乳酸菌的測定：參照GB 4789.35—2016《食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》；霉菌及酵母計數：參照GB 4789.15—2016《食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數》。

2 結果與分析

2.1 黑枸杞-刺梨風味發酵乳發酵工藝優化單因素試驗

2.1.1 黑枸杞汁添加量對風味發酵乳的影響

由圖1可知，隨著黑枸杞汁添加量的增加，感官評分呈先升高后下降的趨勢，蛋白質的含量呈下降的趨勢，但變化不明顯。當黑枸杞汁添加量＜12%，風味發酵乳色澤較差，呈暗灰色；隨著黑枸杞汁的增加色澤逐漸改善，當黑枸杞汁的添加量為12%時，感官評分達到最高，為83.56分，蛋白質含量為2.81 g/100 g，發酵乳呈香芋色，有枸杞清淡的香味；當黑枸杞汁添加量＞12%，發酵乳顏色較深，色澤不佳。故選擇12%為最適添加量。

圖1 黑枸杞汁添加量對風味發酵乳感官評分及蛋白質含量的影響Fig. 1 Effect of black wolfberry juice addition on sensory score and protein content of flavor fermented milk

2.1.2 刺梨汁添加量對風味發酵乳的影響

由圖2可知，隨著刺梨汁添加量的增加，感官評分呈先升高后下降的趨勢，蛋白質的含量呈下降的趨勢。當刺梨汁添加量＜5%，風味發酵乳刺梨風味較淡；當刺梨添加量為5%時，發酵乳有刺梨的清香，感官評分最高，為84.34分，蛋白質含量為2.86 g/100 g；當刺梨汁添加量＞5%，發酵乳色澤為暗黃色，呈酸澀味，且隨著刺梨汁的增加，澀味增加。故選擇最適刺梨汁添加量為5%。

圖2 刺梨汁添加量對風味發酵乳感官評分及蛋白質含量的影響Fig. 2 Effect of Rosa roxburghii juice addition on sensory score and protein content of flavor fermented milk

2.1.3 蔗糖添加量對風味發酵乳的影響

由圖3可知，隨著蔗糖添加量的增加，風味發酵乳的感官評分及蛋白質含量呈先升高后下降的趨勢，但蛋白質含量變化不明顯。當蔗糖添加量＜6%，發酵乳甜度不足，較酸；當蔗糖添加量為6%時，發酵乳酸甜合適，感官評分最高，為87.75分，蛋白質含量為2.84 g/100 g；當蔗糖添加量＞6%，發酵乳偏甜。故選擇蔗糖添加量為5%、6%、7%作為響應面參數。

圖3 蔗糖添加量對風味發酵乳感官評分及蛋白質含量的影響Fig. 3 Effect of sucrose addition on sensory score and protein content of flavor fermented milk

2.1.4 發酵時間對風味發酵乳的影響

由圖4可知，隨著發酵時間的延長，風味發酵乳的感官評分呈先升高后下降的趨勢，蛋白質含量呈下降的趨勢，但變化不明顯。當發酵時間＜6 h，發酵乳凝固型不好，有乳清析出；當發酵時間為6 h時，發酵乳的感官評分最高，為87.55分，蛋白質含量為2.84 g/100 g，發酵后凝固型較好，酸甜感最佳，口感細膩柔和；當發酵時間＞6 h，發酵乳酸甜不合適。故選擇最適發酵時間為6 h。

圖4 發酵時間對風味發酵乳感官評分及蛋白質含量的影響Fig. 4 Effect of fermentation time on sensory score and protein content of flavor fermented milk

2.1.5 菌種ABY-10接種量對風味發酵乳的影響

由圖5可知，隨著菌種ABY-10接種量的增加，風味發酵乳的感官評分呈先升高后下降的趨勢，蛋白質含量呈下降的趨勢。當菌種接種量＜0.003%，發酵乳凝固性不好，狀態不佳；當菌種接種量為0.003%時，發酵乳的狀態較好，酸甜合適，此時感官評分最高為89.05分，蛋白質含量為2.84 g/100 g；當菌種接種量＞0.003%之后，發酵乳逐漸變酸，酸甜比例不合適。故選擇最適菌種接種量為0.003%。

圖5 菌種ABY-10接種量對風味發酵乳感官評分及蛋白質含量的影響Fig. 5 Effect of strain ABY-10 inoculum on sensory score and protein content of flavor fermented milk

2.2 黑枸杞-刺梨風味發酵乳發酵工藝優化響應面試驗

依據單因素試驗結果，確定黑枸杞汁的添加量為12%，以感官評分（R1）和蛋白質含量（R2）為響應值，選擇對黑枸杞-刺梨風味發酵乳影響顯著的4個因素刺梨汁添加量（A）、菌種接種量（B）、發酵時間（C）和蔗糖添加量（D）進行4因素3水平的響應面優化試驗，各因素評價的投票數見表4，響應面試驗設計及結果見表5，以感官評分為響應值回歸模型的方差分析結果見表6。

表4 黑枸杞-刺梨風味發酵乳感官評價票數分布Table 4 Distribution of sensory evaluation votes of fermented black wolfberry-Rosa roxburghii flavor milk

表5 響應面試驗設計與結果Table 5 Design and results of response surface experiments

表6 以感官評分為響應值回歸模型的方差分析結果Table 6 Variance analysis results of regression model using sensory score as response value

續表

采用表4中的數據建立模糊評價矩陣，將每個樣品的各自影響因素的得票數除以總參與評價人數（10）即可得到各個模糊矩陣U1～U29，以1號產品為例：色澤的評價人數分別為：8人選優，2人選良，0人選中，0人選差，則U色澤=（0.8，0.2，0，0），同理，U狀態=（0.7，0.2，0.1，0），U滋味=（0.2，0.2，0.3，0.3），U氣味=（0.8，0.2，0，0），由此可得到矩陣U1：

根據模糊數學計算原理和權重集M=（M1，M2，M3，M4）=（0.35，0.25，0.14，0.26），按照矩陣相乘方法，感官評價結果F1=M×U1=（0.564，0.200，0.131，0.105），對于F中的各個量，分別賦予其相應分值，優、良、中、差分別為90分、80分、70分、60分，F中各個值分別乘以相應分值，再相加即可得到1號樣品感官評分，即1號樣品感官評分：T1=0.564×90+0.2×80+0.131×70+0.105×60=82.23，同理可以計算出2～29號樣品的感官得分。

對表5中的數據進行回歸擬合分析，得到的回歸方程為R1=87.40-4.28A-1.39B+1.28C+1.47D+1.05AB+0.99AC+0.062AD+1.15BC+2.76BD-0.21CD-5.40A2-2.57B2-3.51C2-5.24D2；R2=2.76-0.10A-4.167E-0.03B+0.021C-0.018D-7.500E-003AB-0.018D-7.500E-003AB-0.015AC+7.500E-0.03AD-5.000E-003BC+2.500E-003CD+2.500E-003CD+0.028A2+4.167E-003B2+0.019C2+7.917E-003D2。

復相關系數R2∈[0，1]，它的值越接近1誤差影響就越小，回歸方程越準確[19-20]。R2可以描述響應曲面的擬合程度，但它的值會隨著回歸方程中自變量個數的改變而發生改變[21-26]。由表6可知，模型的P＜0.000 1，說明試驗所采用的二次回歸模型是極顯著的。失擬項P=0.079 9＞0.05，說明對模型是有益的，模型具有高度可靠性[23-25]。對試驗模型的可信度進行分析，得到決定系數R2=0.929 1，表明響應值的變化92.91%來自于所選因素，方程的擬合度較好，方程的調整決定系數R2Adj=0.858 1，說明有85.81%的試驗符合該模型，與實際情況符合良好[25-28]。變異系數（coefficient of variation，CV）=2.37%，較小，表明方程模型具有良好重現性[29]。由表6亦可知，一次項A，二次項A2、B2、C2、D2對結果影響極顯著（P＜0.01），一次項B、C、D，交互項BD對結果影響顯著（P＜0.05）。根據F值，各因素對試驗結果影響的先后次序為A＞D＞B＞C。交互項BD對結果影響的響應面及等高線見圖6。

圖6 菌種ABY-10接種量及蔗糖添加量交互作用對黑枸杞-刺梨風味發酵乳感官評分影響的響應面及等高線Fig. 6 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between strain ABY-10 inoculum and sucrose addition on the sensory score of fermented black wolfberry-Rosa roxburghii flavor milk

響應面越陡峭，等高線越密集，表明該因素對試驗結果影響越顯著[29]。由圖6可知，BD響應面較陡峭，等高線越接近于橢圓形，說明BD交互項對結果影響顯著，與方差分析結果一致。以蛋白質含量為響應值回歸模型的方差分析結果見表7。

由表7可知，模型的P＜0.000 1，說明試驗所采用的二次模型是極顯著的；失擬項P=0.199 7＞0.05，說明對模型是有益的，模型具有高度可靠性[23-24]。對試驗模型的可信度進行分析，得到決定系數R2=0.961 1，表明響應值的變化96.11%來自于所選因素，方程的擬合度較好，方程的調整決定系數R2Adj=0.922 2，說明有92.22%的試驗符合該模型，與實際情況符合良好[25-28]。CV=0.73%，較小，說明方程模型具有良好重現性[29]。一次項A、C、D，二次項A2對結果影響極顯著（P＜0.01），二次項C2對結果影響顯著（P＜0.05）。根據F值，各因素對試驗結果影響的先后次序為A＞C＞D＞B。

表7 以蛋白質含量為響應值回歸模型的方差分析結果Table 7 Variance analysis results of regression model using protein content as response value

利用Design-Expert 10.0.7對感官評分和蛋白質含量回歸方程進行回歸分析，黑枸杞-刺梨風味發酵乳的最佳發酵工藝為：刺梨汁添加量4.28%，菌種ABY-10接種量0.003 4%，發酵時間6.071 h，蔗糖添加量6.05%。在此優化條件下，風味發酵乳感官評分的理論值為88.596分，蛋白質含量為2.80 g/100 g。考慮到實際工藝條件，調整最佳發酵工藝條件為刺梨汁添加量4.3%，菌種ABY-10接種量0.003%，發酵時間6 h，蔗糖添加量6%。在此優化條件下進行3次平行驗證試驗，感官評分及蛋白質含量分別為（88.58±0.08）分、（2.79±0.01）g/100 g，與預測值接近，說明該模型可以用于優化黑枸杞-刺梨風味發酵乳發酵工藝。

2.3 黑枸杞-刺梨風味發酵乳理化及微生物指標

黑枸杞-刺梨風味發酵乳的感官品質、理化指標及微生物指標分別見表8～表10。由表8～表10可知，黑枸杞-刺梨風味發酵乳的感官品質、理化和微生物指標均符合相關國標要求。

表8 黑枸杞-刺梨風味發酵乳的感官品質Table 8 Sensory quality of fermented black wolfberry-Rosa roxburghii flavor milk

表9 黑枸杞-刺梨風味發酵乳的理化指標Table 9 Physicochemical indexes of fermented black wolfberry-Rosa roxburghii flavor milk

表10 黑枸杞-刺梨風味發酵乳的微生物指標Table 10 Microbial indexes of fermented black wolfberry-Rosa roxburghii flavor milk

3 結論

以刺梨干果、黑枸杞、純牛奶為原料，以感官評分、蛋白質含量為評價指標，利用模糊數學評價結合響應面法優化得到黑枸杞-刺梨風味發酵乳的最優發酵工藝為：黑枸杞汁添加量12.0%，刺梨汁添加量4.3%，蔗糖添加量6.0%，菌種ABY-10接種量0.003%，發酵時間6 h。在此優化條件下，黑枸杞-刺梨風味發酵乳的感官評分為88.60分，蛋白質含量為2.80 g/100 g，其感官指標、理化指標及微生物指標均符合相關國標要求。