谷物食品中紅木素和降紅木素的快速篩查方法的建立

朱萬燕，張 偉，宋衛得

（1.臨沂海關綜合技術服務中心，山東 臨沂 276034；2.東營海關，山東 東營 257000；3.日照海關，山東 日照 276800）

谷物類食品是人類的重要食品來源之一，在人類的膳食結構中占有重要地位[1]，此外，由于全谷物食品最大程度地保留了谷物中的營養與活性成分，在預防慢性病等多個領域的健康功效得到了充分驗證，愈來愈受到消費者的認同和重視[2]。近年來，隨著人們生活水平的提高，即食谷物類食品品種越來越多，為了增加產品的色澤，生產企業在生產過程中加入各種各樣的色素，以吸引消費者[3-4]。紅木素和降紅木素是經不同提取溶劑從紅木種子中提取得到的食用天然色素[5]。該類色素因其色澤光亮鮮艷、著色力強，受到食品生產企業的青睞[6]，廣泛應用到食品加工中。為了規范紅木素和降紅木素的合理使用，我國對該類色素的適用范圍和限量進行了明確的規定[7]：用于干酪限量0.6 g/kg；人造奶油限量0.05 g/kg；糖果、果醬、飲料、果凍限量0.6 g/kg；糕點限量0.015 g/kg；肉灌腸類、西式火腿、巧克力限量0.025 g/kg；復合調味料限量0.1 g/kg；膨化食品、面糊、裹粉、煎炸粉限量0.01 g/kg；方便米面制品限量0.012 g/kg；即食谷物類食品限量0.07 g/kg；粉圓限量0.15 g/kg。

食品中關于合成色素的檢測報道較多，但關于食用天然色素的檢測研究較少[8-12]。目前，國外文獻中有關食用天然色素紅木素和降紅木素的報道大多是從紅木種子中提取該類色素的報道[13-15]，有關食品中該類色素檢測的探討不多[16-17]；國內文獻中有關紅木素和降紅木素檢測的基質大多是飲料、奶酪等[18-20]，未見有即食谷物類食品中該類色素的檢測；在檢測標準方面，國內也只有一個進出口食品的檢測標準[21]。因此，為了維護消費者權益、推動該天然色素的合理使用，建立即食谷物類食品中紅木素和降紅木素的快速檢測方法顯得迫切且必要。

此外，目前用于食品中紅木素和降紅木素的檢測設備主要是液相色譜儀[22-23]、液相色譜串聯質譜儀[24]。上述檢測設備定性準確度方面尚有不足，不能準確闡明化合物的裂解信息，且對前處理的要求較高，操作繁復、耗時長，不適合樣品的批量檢測。超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質譜（ultra performance liquid chromatography coupled with quadrupole-timeofflightmassspectrometry，UPLC-Q-TOF/MS）儀具有抗干擾能力更強、定性準確度更高的特點[25]，如可以在滿足化合物檢出限的前提下，簡化樣品前處理操作步驟，則可以大幅提高工作效率。以即食谷物食品為基質，以期建立即食谷物類食品中紅木素和降紅木素的超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質譜檢測方法，能準確、簡單、快速應用于批量樣品的檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

即食谷物類食品（餅干、麥片、玉米片、核桃粉、芝麻糊等）：市售。

紅木素標準物質（CAS號6983-79-5）、降紅木素標準物質（CAS號542-40-5）（純度均≥98%）：美國ChromaDex公司；乙腈、甲酸、乙酸銨（色譜純）：美國Tedia公司；實驗用水為美國Millipore純水系統制得的超純水。

1.2 儀器與設備

1290-6530型超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質譜儀（UPLC-Q-TOF MS）：美國安捷倫公司；CR22GⅢ日立高速冷凍離心機：日本HITACHI公司；ULTRA-TURRAX T25型均質器、GENIUS 3渦旋混勻器、HS260型多用調速振蕩器：德國IKA公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液配制

標準儲備液：準確稱取相當于50 mg目標待測物的標準品分別于50 mL燒杯中，用甲醇溶解并定量轉移至25 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制質量濃度為2 mg/mL的標準儲備液，4 ℃避光保存。

標準工作液：實驗過程中依據不同待測分析物的定量限，用樣品制得的空白提取液逐級稀釋標準儲備溶液，配制成不同濃度的系列基質標準混合工作液，現用現配。

1.3.2 樣品前處理

樣品預先打碎混合均勻備用。精確稱取2.00 g樣品，置于50 mL具塞離心管中，加入10 mL 5%醋酸-乙腈溶液，均質提取1 min，然后置于水平振蕩器上振蕩30 min，以9 000 r/min冷凍（-2 ℃）離心5 min，取上清液過0.22 μm濾膜，濾液待測。

1.3.3 儀器工作條件

液相色譜條件：ZORBAXSB-C18色譜柱（100mm×2.1mm，3.5 μm）；流動相A為乙腈，B為0.1%甲酸水溶液（含5 mmol/L乙酸銨），梯度洗脫程序：0～0.5 min，95%A；0.5～5 min，95%～60%A；5～9 min，60%～5%A；9～14 min，5%A；14～14.1 min，5%～95%A；14.1～18 min；95%A；流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量10 μL。

質譜條件：電噴霧離子（electrospray ionization，ESI）源，正離子模式；霧化氣壓力45 psi；干燥氣溫度300 ℃；干燥氣流速12 L/min；鞘氣溫度300 ℃；鞘氣流速12 L/min；毛細管電壓4 500 V；噴嘴電壓1 000 V；傳輸電壓110 V；除液電壓65 V；掃描范圍為50～1 700 m/z，掃描速率為3 spectra/s；數據采集與數據處理（定性分析和定量分析）均采用設備自帶軟件（version B.04.00）。

1.3.4 數據庫的建立

數據譜庫一般包括化合物名稱、分子式、理論相對分子質量、離子化形式、保留時間、子離子掃描圖等信息，化合物名稱、分子式、理論相對分子質量可從標準物質證書上獲得，離子化形式、保留時間、子離子掃描圖均從實驗獲得。上述實驗中已經確定待測分析物的離子化形式為[M+H]+。

保留時間的確定：在上述確定的色譜質譜條件下，配制質量濃度為1 mg/L的標準溶液，進行全掃描并采集數據，依據待測分析物的分子式及理論相對分子質量，確認其色譜峰，進而獲得其色譜保留時間。

子離子掃描圖的獲得：子離子掃描模式下，在Targeted MS/MS界面輸入待測物的保留時間，母離子和不同的碰撞能量并采集數據，獲得不同碰撞能量下的子離子掃描質譜圖，選取碎片離子信息豐富且碎片離子突出的質譜圖作為子離子掃描圖，與對應的待測物信息相關聯并保存。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

實驗比較了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-5 mmol/L乙酸銨溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液（含5 mmol/L乙酸銨）四種不同流動相體系下紅木素和降紅木素的出峰情況，其離子流色譜圖見圖1。結果表明，紅木素和降紅木素在酸性體系下的響應高于非酸性體系下的響應，而且峰形也好；體系中加入乙酸銨后目標化合物間及目標化合物與雜峰間的分離度也有所改善，因此，最終選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液（含5 mmol/L乙酸銨）作為實驗用流動相。

圖1 紅木素（A）及降紅木素（B）的總離子流色譜圖Fig. 1 Total ions chromatograms of bixin (A) and norbixin (B)

2.2 質譜條件的優化

實驗比較了正、負離子全掃描模式，結果表明，紅木素和降紅木素在負模式下沒有響應，只有在正離子模式下有響應，因而實驗采用正離子模式進行掃描。

正離子模式下，目標分析物紅木素和降紅木素有[M+H]+、[M+Na]+兩種離子化形式，且兩種化合物[M+H]+離子化形式的響應均高于[M+Na]+離子化的響應，結果見圖2。因此實驗最終選擇[M+H]+離子化形式作為目標化合物的母離子，并用于數據庫檢索。

圖2 紅木素（A）及降紅木素（B）不同離子化形式的響應Fig. 2 Response of bixin (A) and norbixin (B) in different ionic forms

紅木素、降紅木素的保留時間、理論相對分子質量和特征離子見表1。

表1 紅木素、降紅木素的保留時間和MS參數Table 1 Retention time and MS parameters of bixin and norbixin

2.3 方法考察

2.3.1 方法的線性和定量限

選取經測定不含有目標化合物的樣品，按實驗方法進行處理，得到的提取液作為空白基質溶液，用空白基質溶液逐級稀釋標準儲備液，配制成質量濃度在0.5～70 mg/kg范圍內的系列基質混合標準工作溶液，上機測定，以母離子色譜峰面積為縱坐標（Y），質量濃度為橫坐標（X）獲得目標化合物的線性回歸方程。用空白基質溶液逐級稀釋標準儲備液，直至每種目標化合物的信噪比（S/N）=10，此時對應的化合物質量濃度即為該化合物的定量限（limit of quantitation，LOQ）。紅木素、降紅木素的線性范圍、線性方程、相關系數和定量限見表2。

表2 紅木素及降紅木素的線性范圍、線性方程、相關系數及定量限Table 2 Linear range, linear equation, correlation coefficient and quantitation limits of bixin and norbixin

從表2可以看出，兩種化合物在1.0～70 mg/kg和0.5～70 mg/kg的質量濃度范圍內，相關系數（R）均大于0.99，線性關系良好；此外，兩種化合物的定量限分別為1.0 mg/kg和0.5 mg/kg，遠遠低于其允許使用的限量，完全能夠滿足快速篩查的需要。

2.3.2 方法回收率和精密度

在經測定不含有待測物質的餅干、全麥片、玉米片3種樣品中分別添加1倍、5倍、10倍LOQ和70 mg/kg四個質量濃度水平的加標回收試驗，每個加標水平平行做6次，計算其回收率和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），結果見表3。由表3可知，兩種化合物的平均加標回收率在71.5%～110.6%之間，相對標準偏差均不高于10.2%。

表3 不同食品中紅木素和降紅木素的加標回收率和精密度Table 3 Standard recovery and precision of bixin and norbixin in different foods

2.3.3 實際樣品檢測

應用本方法對40件購自超市的餅干、麥片、玉米片、核桃粉、芝麻糊等樣品進行檢測分析，結果只有一件夾心餅干樣品檢出降紅木素，檢出值為3.0 mg/kg。

3 結論

本研究建立了即食谷物食品中紅木素和降紅木素的超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質譜檢測法，紅木素和降紅木素兩種化合物分別在1.0～70 mg/kg、0.5～70 mg/kg范圍內具有較好的線性關系，相關系數（R）均大于0.99，其定量限分別為1.0 mg/kg、0.5 mg/kg，平均加標回收率在71.5%～110.6%范圍內，相對標準偏差（RSD）均不高于10.2%。該方法操作簡單、快速、定性準確度高，適用于批量樣品的快速篩查，可為食品安全監管提供有效保障。