茯苓、白芷、白扁豆混合物中總多糖提取工藝優(yōu)化

曹 菁，張雪元*，周 彬，王 晨，郝江偉

（1.勁牌持正堂藥業(yè)有限公司，湖北 黃石 435000；2.中藥保健食品與安全湖北省重點實驗室，湖北 大冶 435100）

多糖廣泛存在于植物中，它是構成生物生命活動的最重要的基本物質之一。茯苓（Poria cocos）為多孔菌科真菌的干燥菌核，多糖是茯苓的主要活性成分，約占其菌核干質量的70%～90%[1-4]，現(xiàn)代研究表明茯苓多糖具有抗腫瘤、抗炎、抗衰老、抗氧化等生物活性[5-8]。白芷（Angelica dahurica）為傘形科植物白芷或杭白芷的干燥根，其中多糖含量達34.14%[1，9]。白芷多糖具有體外抗氧化、抑制酪氨酸酶活性、調節(jié)免疫力功效[9-12]。白扁豆（Dolichos lablab）為豆科植物扁豆的干燥成熟種子，主要成分是多糖，含量為50%左右[1，13]。白扁豆多糖具有抗菌、抗病毒、抗氧化等功效[14-16]。

茯苓多糖主要存在細胞壁中，常見溶劑提取法包括水提法和堿提法，其中以水為溶劑，操作安全、無毒[17-18]。屈賀冪[19]研究了茯苓多糖水提工藝，在單因素試驗基礎上采用正交試驗優(yōu)化得到最佳浸提工藝參數(shù)為浸提溫度90 ℃，浸提時間7.4 h，水料比9.4倍，在此條件下，茯苓多糖得率為0.758%。目前，白芷多糖常用水為提取溶劑[20]，王德才等[21]經(jīng)脫脂、醇提后，采用水提醇沉法得杭白芷多糖的含量達15.38%，浸提工藝為95 ℃，浸提3次，每次2 h，分別加入6倍、5倍、4倍蒸餾水。于鑫等[22]以白扁豆為原料，以水為溶劑，通過響應面法優(yōu)化建立多糖提取方法，浸提溫度為70 ℃，浸提時間為100 min，液料比為70∶1（mL∶g），在此條件下，白扁豆多糖得率為0.96%。

很多古方記載及現(xiàn)代醫(yī)學證明，某些白色類中藥具有美白、抗衰老、抗皺等功效[23]。如美白古方八白散由1∶1的茯苓、白芷等藥材組成，具有潤澤肌膚、日用面如玉作用[24]；出自清《醫(yī)學集成（卷二）》的八仙糕中含有1∶1的茯苓、白扁豆等藥材，長期服用具有益壽延年的作用[25]；清代美容方劑玉容散中含有1∶1∶1白芷、茯苓、白扁豆等藥材，用其洗面可以令肌膚白嫩[26]。目前，鮮有關于茯苓、白芷、白扁豆混合料多糖的提取研究報道。

本研究選用茯苓、白芷、白扁豆飲片混合料（1∶1∶1），采用水浸提方法提取其總多糖，以總多糖得率為評價指標，考察提取次數(shù)、提取溫度、提取時間、液料比對總多糖提取效果的影響，通過單因素試驗與正交試驗優(yōu)化總多糖提取工藝，以期為茯苓、白芷、白扁豆綜合應用提供參考和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

茯苓飲片、白芷飲片（均符合2020版《中國藥典》標準）：湖北正光九資河藥業(yè)有限公司；白扁豆飲片（符合2020版《中國藥典》標準）：湖北天濟中藥飲片有限公司；D-無水葡萄糖（純度≥99.9%）標準品：中國食品藥品檢定研究院；濃硫酸、苯酚（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

TU951型紫外可見光分光光度計：北京譜析通用儀器有限責任公司；OSB-2200水浴鍋、EYEL4 N-1100型旋轉蒸發(fā)儀、vacuubrand 2C型真空泵、CA-111型冷卻水循環(huán)裝置：上海愛朗儀器有限責任公司；SQP型電子天平（0.01 mg）：賽多利斯科學儀器有限公司；DSW-S-8電熱恒溫水浴鍋：北京光明醫(yī)療儀器有限公司；JJ1000型電子天平（0.01 g）：常熟市雙杰測試儀器廠；SK8200LHC超聲波清洗器：上海超導超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 混合料總多糖提取工藝優(yōu)化單因素試驗

稱取茯苓、白芷、白扁豆飲片各20.00 g，分別考察提取次數(shù)（1、2、3、4）、提取溫度（75 ℃、80 ℃、85 ℃、90 ℃、95 ℃）、提取時間（1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h）、液料比（6∶1、10∶1、14∶1、18∶1、22∶1（mL∶g））對茯苓、白芷、白扁豆混合料總多糖得率的影響。

1.3.2 混合料總多糖提取工藝優(yōu)化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，以總多糖得率（Y）為評價指標，選擇液料比（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）作為變量，設計3因素3水平L9（33）正交設計優(yōu)化茯苓、白芷、白扁豆混合料提取工藝條件。正交試驗因素與水平見表1。

表1 茯苓、白芷、白扁豆混合料提取工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for extraction process optimization of tuckahoe, angelica and Baibiandou mixture

1.3.3 總多糖含量檢測

總多糖含量檢測參照文獻[27]。設定吸光度值波長為495 nm，以吸光度值（y）為縱坐標，葡萄糖質量濃度（x）為橫坐標，繪制標準曲線，得到標準曲線回歸方程為y=0.057 9x+0.009 5，相關系數(shù)R2=0.999 6。根據(jù)標準曲線回歸方程計算樣品中總多糖得率，公式如下：

式中：W表示總多糖得率，%；c表示根據(jù)吸光度值計算出的溶液質量濃度，mg/mL；D表示溶液稀釋倍數(shù)；V表示供試品溶液體積，mL；m表示飲片稱樣量，mg。

2 結果與分析

2.1 混合料總多糖提取工藝優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 提取次數(shù)的確定

提取次數(shù)對茯苓、白芷、白扁豆混合料總多糖得率的影響結果見圖1。

圖1 提取次數(shù)對總多糖得率的影響Fig. 1 Effect of extraction times on yield of total polysaccharides

由圖1可知，提取1次總多糖得率為5.12%，提取2次總多糖得率為7.8%，提取3次總多糖得率為9.07%，第4次提取總多糖得率增加不明顯，且多次提取操作繁瑣，耗時較長。綜合考慮，確定提取次數(shù)3次為宜。

2.1.2 提取溫度的確定

提取溫度對茯苓、白芷、白扁豆混合料總多糖得率的影響見圖2。

圖2 提取溫度對總多糖得率的影響Fig. 2 Effect of extraction temperature on yield of total polysaccharides

由圖2可知，隨著提取溫度在75～85 ℃范圍內的升高，茯苓、白芷、白扁豆混合料總多糖得率增加，溫度高于85 ℃時，總多糖得率處于平穩(wěn)上升趨勢，當提取溫度達到95 ℃時，總多糖得率最高，為8.36%。造成這種現(xiàn)象是由于多糖分子之間的運動速度隨著提取溫度的上升而不斷加快，而細胞組織中的多糖組分與溶劑之間的傳質運動速度也隨之加快的原因[28]。因此，確定提取溫度95 ℃為宜。

2.1.3 提取時間的確定

提取時間對茯苓、白芷、白扁豆總多糖得率的影響見圖3。

圖3 提取時間對總多糖得率的影響Fig. 3 Effect of extraction time on yield of total polysaccharides

由圖3可知，提取時間在1.0～2.5 h范圍內時，茯苓、白芷、白扁豆總多糖得率隨提取時間的增加而升高；當提取時間達到2.5 h時，總多糖得率最高，為8.73%；繼續(xù)增加提取時間至3.0 h時，總多糖得率有所下降。這可能是由于提取時間過長，導致多糖內部結構破壞[29]，降低了總多糖得率。此外，加熱時間過長，能耗增加。因此，確定提取時間2.5 h適宜。

2.1.4 液料比的確定

液料比對茯苓、白芷、白扁豆總多糖得率的影響見圖4。

圖4 液料比對總多糖得率的影響Fig. 4 Effect of liquid to solid ratio on yield of total polysaccharides

由圖4可知，液料比為6∶1、10∶1時，隨著液體占比增加，總多糖得率升高，當液料比為10∶1時，總多糖得率為8.94%，繼續(xù)增加液體占比，至液料比至22∶1，總多糖得率呈緩慢上升趨勢。這是因為隨著料液用量不斷增加，細胞內外的滲透壓也隨之增加，多糖浸出越多，然而繼續(xù)增加料液，細胞內外滲透壓趨于平衡，多糖提取率呈緩慢上升趨勢[30]。在車間提取罐體積一定的條件下，液料比過大，會造成過多的溶劑浪費。因此，確定液料比10∶1適宜。

2.2 正交試驗優(yōu)化茯苓、白芷、白扁豆混合料總多糖提取工藝

正交試驗設計以單因素試驗所得最優(yōu)提取條件為基礎，選擇液料比（A）、提取溫度（B）、提取時間（C）為影響因素，以總多糖得率為考察指標進行3因素3水平正交試驗。茯苓、白芷、白扁豆總多糖混合提取工藝優(yōu)化正交試驗結果與分析見表2，方差分析見表3。

表2 茯苓、白芷、白扁豆混合料總多糖提取工藝優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction process optimization of total polysaccharides from tuckahoe,angelica and Baibiandou mixture

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analyasis of orthogonal experiments results

由表2可知，對總多糖得率的影響因素的主次順序依次為提取溫度（B）＞液料比（A）＞提取時間（C），最佳茯苓、白芷、白扁豆混合料中總多糖提取工藝組合為A2B3C2，即液料比10∶1（mL∶g）、提取溫度95 ℃、提取時間2.5 h，提取3次。在此最佳條件下進行3次平行驗證試驗，總多糖平均提取率為8.88%。由表3可知，提取溫度對結果影響具有顯著性差異（P＜0.05），液料比、提取時間對結果影響無顯著性差異（P＞0.05）。

3 結論

選用茯苓、白芷、白扁豆飲片為原料，采用浸提法提取其總多糖，通過單因素試驗與正交試驗優(yōu)化混合料多糖的提取工藝。結果表明，茯苓、白芷、白扁豆混合料總多糖的最佳提取工藝為提取溫度95 ℃、液料比10∶1（mL∶g）、提取時間2.5 h、提取3次。在此優(yōu)化條件下，總多糖得率為8.88%。因此，采用該工藝提取茯苓、白芷、白扁豆3種飲片的總多糖，總多糖得率較高，工藝穩(wěn)定可行。