利用臨床血常規(guī)標(biāo)本富集血細(xì)胞在血液分析儀線性驗證中的應(yīng)用評價

王力，陽振曦，程焱，崔巍

(國家癌癥中心 國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院檢驗科，北京100021)

隨著ISO 15189醫(yī)學(xué)實驗室認(rèn)可工作的不斷推進(jìn)以及實驗室管理的逐步規(guī)范，驗證血液分析儀的檢測性能已基本成為臨床實驗室的常規(guī)工作之一。按照衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/T 406—2012《臨床血液學(xué)檢驗常規(guī)項目分析質(zhì)量要求》的相關(guān)規(guī)定，需驗證的項目應(yīng)包括：本底計數(shù)、攜帶污染、精密度、正確度、線性、可比性等[1]。但是目前商品化的線性質(zhì)控物較少且缺乏有效的購買渠道，大部分醫(yī)院在短期內(nèi)遇到涵蓋所有項目的臨床極端高值樣品的可能性很小，所以如何及時有效地進(jìn)行線性評價是目前血液分析儀性能驗證工作中的一個難點[2]。為解決這一難題，現(xiàn)介紹一種可簡單獲得血液分析儀高濃度線性驗證樣品的方法供大家參考。

1 材料與方法

1.1主要儀器與試劑 XN-350血液分析儀及其配套試劑、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品(日本Sysmex公司)。Heraeus Labofuge 400及Heraeus Multifuge 4 KR離心機(jī)(德國Thermo Scientific公司)。

1.2標(biāo)本采集與處理 按照標(biāo)準(zhǔn)操作流程[3]采集新鮮全血標(biāo)本，EDTA-K2抗凝，用于血常規(guī)檢測，完成檢測并留取備份后的剩余標(biāo)本用于本實驗研究。

1.3方法

1.3.1高濃度紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(Hb)和血細(xì)胞比容(HCT)樣品的制備 選取當(dāng)天同血型全血標(biāo)本4份(RBC盡量>5.00×1012/L)，混合成2份后用Heraeus Multifuge 4 KR離心機(jī)2 000 r/min離心3 min；用一次性塑料吸管去除大部分血漿后將剩余血細(xì)胞混合于1支試管中，獲得約3 mL高濃度RBC、Hb和HCT樣品。

1.3.2高濃度白細(xì)胞(WBC)和血小板(PLT)樣品的制備 (1)選取當(dāng)天全血標(biāo)本(ABO血型可能不同，盡量選取WBC和PLT測定結(jié)果較高的標(biāo)本，如WBC>15.00×109/L、PLT>250×109/L)40份，混合后倒入8支10 mL離心管中。(2)用Heraeus Labofuge 400離心機(jī)3 000 r/min離心10 min，用一次性塑料吸管盡量提取中間富含WBC和PLT的白膜層(提取時會混有一定量的血漿、紅細(xì)胞)混合備用(約12 mL分裝至4支EDTA-K2抗凝真空采血管內(nèi))。(3)搖勻后放入Heraeus Multifuge 4 KR離心機(jī)中，再次3 000 r/min離心5～10 min，用一次性塑料吸管再次盡量提取中間白膜層混合備用(約6 mL分裝至2支EDTA-K2抗凝真空采血管內(nèi))。(4)重復(fù)步驟3，進(jìn)一步富集WBC和PLT，提高其濃度，得到約3 mL高濃度WBC和PLT樣品。

1.3.3線性驗證樣品的制備與檢測 用XN-350血液分析儀配套稀釋液[4]將上述高濃度血細(xì)胞樣品分別按100%、80%、60%、40%、20%、10%、2%、0%的比例進(jìn)行稀釋，稀釋好的樣品放置滾軸混勻器上進(jìn)行混勻備用。每個稀釋度的樣品重復(fù)測定3次。

1.4統(tǒng)計分析 依據(jù)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/T 406—2012《臨床血液學(xué)檢驗常規(guī)項目分析質(zhì)量要求》，按照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/T 408—2012《臨床化學(xué)設(shè)備線性評價指南》的相關(guān)計算指標(biāo)以及公式等采用R語言統(tǒng)計分析線性數(shù)據(jù)[5]。首先，采用格拉布斯(Grubbs)法進(jìn)行離群值檢驗，剔除離群值。然后，對線性驗證數(shù)據(jù)進(jìn)行多項回歸分析，確定最優(yōu)擬合方程；如數(shù)據(jù)擬合結(jié)果為統(tǒng)計學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的非線性，則需按照指南中的公式計算最優(yōu)擬合曲線與直線的平均差異值(average deviation from linearity，ADL)，并與臨界值進(jìn)行比較以判斷是否為臨床可接受的非線性。最后，按照指南中的公式計算數(shù)據(jù)的不精密度，與界值進(jìn)行比較從而檢驗線性驗證數(shù)據(jù)的精密度，以保證多項回歸分析統(tǒng)計學(xué)的準(zhǔn)確性。具體計算公式參照指南中相應(yīng)內(nèi)容以及相關(guān)文獻(xiàn)資料[6]。

2 結(jié)果

2.1高濃度血細(xì)胞樣品的制備 將富集的高濃度血細(xì)胞樣品用Sysmex XN-350血液分析儀進(jìn)行初步檢測，RBC、Hb、HCT、WBC以及PLT的測定結(jié)果分別為8.34×1012/L、262 g/L、76.0%、293.00×109/L和2 387×109/L，達(dá)到預(yù)期要求。

2.2線性驗證數(shù)據(jù)及多項回歸分析結(jié)果 剔除離群值后對驗證數(shù)據(jù)進(jìn)行多項回歸分析，各項目線性驗證不同比例濃度樣品的測定值與最優(yōu)擬合值見表1。各項目線性驗證數(shù)據(jù)的多項回歸分析結(jié)果如圖1所示，Hb與PLT為一階線性，而RBC、HCT和WBC為二階線性，R2均在0.95以上。

表1 各項目線性驗證不同濃度樣品的測定結(jié)果及最優(yōu)擬合值

注：A～E分別為RBC、Hb、HCT、WBC和PLT線性多項回歸分析結(jié)果。

2.3非線性程度判斷及精密度評價 從圖1中可看出RBC、HCT和WBC為統(tǒng)計學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的非線性，需計算ADL值以判定是否為臨床可接受的非線性。RBC、HCT和WBC的ADL計算值分別為1.19%、0.95%和1.99%，均小于臨界值5.25%、5.28%和5.37%，為臨床可接受的非線性。RBC、Hb、HCT、WBC以及PLT線性驗證數(shù)據(jù)的不精密度評估值分別為0.73%、0.58%、0.84%、1.11%和1.39%，均小于判定界值9.76%，說明數(shù)據(jù)的精密度良好，滿足線性驗證數(shù)據(jù)多項回歸分析的統(tǒng)計學(xué)要求。

2.4線性范圍 各項目的實際驗證線性范圍與廠家聲明的線性范圍見表2。由于WBC和PLT樣品制備濃度未達(dá)到廠家聲明的線性上限，導(dǎo)致實際驗證線性范圍低于廠家聲明的線性范圍，但實際驗證線性范圍也基本可滿足絕大部分臨床標(biāo)本的檢測需求。

表2 各項目的實際驗證線性范圍與廠家聲明線性范圍

3 討論

利用臨床標(biāo)本分離PLT和WBC在血液分析儀線性評價中的應(yīng)用雖已有報道[7-9]，但本研究的創(chuàng)新點在于：(1)富集方法簡便、可操作性強(qiáng)，富集制備的樣品項目齊全、濃度值較高,可滿足大部分臨床檢測線性驗證需求，并且一次富集可獲得多個項目同時呈現(xiàn)高濃度值的樣品，可在滿足線性驗證濃度要求的同時節(jié)約檢測成本；(2)線性驗證統(tǒng)計分析方法科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)，保證了線性驗證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

高濃度RBC樣品的制備相對簡單，需要注意的是：因所需臨床標(biāo)本數(shù)量較少，推薦采用血型相同的臨床標(biāo)本；離心轉(zhuǎn)速不需要過高、時間不宜過長，以免因離心力過大造成RBC的破損或因過度擠壓不易混勻，從而影響RBC和HCT的檢測結(jié)果。

制備高濃度WBC和PLT樣品成功的關(guān)鍵點在于：(1)離心轉(zhuǎn)速不易過低，以免離心后PLT處于血漿層而非中間白膜層，造成PLT的丟失；(2)提取中間白膜層時需操作熟練，減少WBC和PLT的丟失，從而提高富集的效率。雖然在選取臨床標(biāo)本時因所需標(biāo)本量較多而未采用同型血相混且富集后的樣品中仍含有一定量的RBC，但制備的樣品并未看到RBC有明顯的凝集或溶血現(xiàn)象。分析原因可能為：當(dāng)多份不同血型血液混合時，血漿中存在的血型物質(zhì)中和了部分血型抗體，從而抑制了血型抗體與紅細(xì)胞之間的凝集反應(yīng)[10]。

美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)H26-A2及EP6-A文件推薦可采用自身無細(xì)胞血漿、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)或儀器廠商推薦的稀釋液對高濃度樣品進(jìn)行稀釋，來配制不同濃度水平的線性驗證樣品[11-12]。本研究采用廠商推薦的可用于儀器預(yù)稀釋模式檢測的配套稀釋液對高濃度樣品進(jìn)行稀釋，是否會造成高濃度樣品與低濃度樣品以及稀釋后的線性驗證樣品與臨床常規(guī)標(biāo)本間基質(zhì)的不同，產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)從而對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響，還有待進(jìn)一步的研究探討。

本研究采用多項回歸分析對線性驗證數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)Hb與PLT為一階線性，而RBC、HCT和WBC為臨床可接受的非線性；線性評價數(shù)據(jù)的精密度均較好，可滿足線性評價的要求。